© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 4b/2015, s. 4-9
*Magdalena Sikora1, Marlena Gołaś2, 3, Katarzyna Piskorska2, 3, Ewa Swoboda-Kopeć2, 3
Ocena pokrewieństwa genetycznego grzybów drożdżopodobnych izolowanych od pacjentów otrzymujących całkowite żywienie pozajelitowe**
Genetic relatedness analysis of yeast like fungal strains isolated from patients with total parenteral nutrition support
1Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
P.o. Kierownika Zakładu: dr hab. n. med. Marta Wróblewska
2Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik Zakładu: prof. nadzw. dr hab. med. Grażyna Młynarczyk
3Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny, Warszawa
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Ewa Swoboda-Kopeć
Streszczenie
Wstęp. Gronkowce, pałeczki Gram-ujemne, jak również grzyby drożdżopodobne są najczęstszymi czynnikami etiologicznymi u chorych otrzymujących całkowite żywienie pozajelitowe (TPN). Wśród grzybów drożdżopodobnych gatunkiem dominującym jest Candida spp.
Cel pracy. Celem przedstawionej pracy była analiza pokrewieństwa genetycznego techniką RAPD szczepów dwóch gatunków: C. albicans i C. glabrata.
Materiał i metody. Analiza pokrewieństwa genetycznego była przeprowadzona na klinicznych szczepach grzybów drożdżopodobnych izolowanych od chorych otrzymujących TPN. Badaniu poddano 31 szczepów Candida glabrata oraz 13 Candida albicans. Badanie pokrewieństwa zostało przeprowadzone przy użyciu metody RAPD.
Wyniki. Wśród grupy 55 szczepów grzybów drożdżopodobnych izolowanych od 37 pacjentów, najliczniejszą grupę stanowiła C. glabrata. Na podstawie analizy wzorów prążkowych pośród wszystkich szczepów C. glabrata wyodrębniono 8 typów genetycznych. Drugim najczęściej izolowanym gatunkiem była C. albicans. Na podstawie analizy wzorów molekularnych szczepów Candida albicans metodą RAPD wyodrębniono 5 typów genetycznych.
Wnioski. 1. Gatunkiem dominującym w materiałach klinicznych od chorych była Candida glabrata z dużą różnorodnością profili genetycznych. 2. Na podstawie analizy pokrewieństwa wykazano 5 przypadków klonalnego rozprzestrzenia się w środowisku szpitalnym szczepów C. glabrata. 3. Klon trzeciego typu genetycznego C. glabrata dwukrotnie spowodował infekcję szpitalną. 4. Wśród szczepów C. albicans zaobserwowano dwukrotnie transmisje klonu w środowisku szpitalnym (klon typu 2 i 3).
Summary
Introduction. The most common etiological infection factors, concerning the patients with TPN, are: staphylococci, gram-negative bacilli, as well as yeastlike fungi. In clinical specimens, the predominant genus of yeastlike fungi, as isolated from the patients with TPN, is Candida spp.
Aim. The study was to epidemiologically analyse Candida albicans and Candida glabrata with RAPD.
Material and methods. Epidemiological analysis was conducted on clinical isolates of the yeastlike fungi cultured from patients who received TPN support. In total 31 C. glabrata and 13 C. albicans were examined. The relatedness analysis was performed with RAPD method (random amplified polymorphic DNA).
Results. Among the 55 strains of the yeastlike fungi isolated from 37 patients receiving TPN the most numerable group constituted C. glabrata. On the base of RAPD analysis among all strains from C. glabrata species of the study group 8 genetic types were distinguished. The second numerable isolated species C. albicans. On the base of RAPD analysis among all strains from C. albicans of the study group 5 genetic types were described.
Conclusions. 1. Candida glabrata was the dominant species in clinical specimens of patients undergoing parenteral nutrition with high diversity of genetic profiles of isolates. 2. The relationship analysis demonstrated five cases of C. glabrata clonal spreading in a hospital environment. 3. The third type of C. glabrata genetic clone caused hospital infections twice. 4. Among the strains of C. albicans clone transmissions in a hospital environment was observed twice (clone type 2 and 3).
Wstęp
Chorzy otrzymujący całkowite żywienie parenteralne stanowią jedną z grup ryzyka wystąpienia infekcji grzybiczej, wśród których dominuje rodzaj Candida. Wrotami zakażenia w tej grupie chorych są przede wszystkim zanikające kosmki jelita cienkiego, poprzez które dochodzi do translokacji patogenu z jego normalnego miejsca bytowania (infekcja endogenna), co prowadzi do kolonizacji narządów (1). Wśród chorych TPN możliwe jest także zakażenie egzogenne, którego źródłem jest skolonizowany cewnik żyły centralnej. Infekcje odcewnikowe postrzegane są jako jedne z najważniejszych komplikacji związanych z TPN (2, 3). Typowanie genetyczne szczepów drożdżaków z rodzaju Candida stanowi obecnie jeden z ważniejszych kierunków badań w przypadku podejrzenia krzyżowego przenoszenia tych drobnoustrojów (4-7). Technika RAPD jest jedną z częściej wykorzystywanych metod molekularnych badania pokrewieństwa szczepów. Umożliwia ona ustalenie genetycznej różnorodności pomiędzy szczepami Candida spp. (8-10). Wyniki uzyskiwane przy użyciu techniki RAPD są powtarzalne wyłącznie w obrębie laboratorium. Technika jest prosta w wykonaniu i szybko umożliwia identyfikację wzorów molekularnych izolatów Candida (11). Metoda daje możliwość ustalenia podobieństw i różnic genetycznych pomiędzy wieloma izolatami uzyskanymi od jednego chorego, a także pomiędzy szczepami izolowanymi od kilku chorych (5, 6, 8, 10, 12). Przy zastosowaniu metody RAPD możliwe jest różnicowanie następujących gatunków: C. albicans, C. galabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei i C. lusitaniae (7, 9, 12-14). Stwierdzono, że analiza oportunistycznych patogenów z rodzaju Candida za pomocą techniki RAPD daje wiarygodne wyniki identyfikacji potencjalnego źródła zakażenia (5, 11) oraz dróg ich transmisji w środowisku szpitalnym (7). Technika RAPD znalazła zastosowanie do analizy różnorodności genotypowej i badania pokrewieństwa genetycznego szczepów Candida pochodzących od chorych z upośledzonym układem odpornościowym, nosicieli wirusa HIV (8) i pacjentów z kandydemią (13). Typowanie molekularne metodą RAPD wykorzystano również do analizy szczepów izolowanych od biorców narządów unaczynionych (15) oraz ustalenia potencjalnego źródła zakażenia grzybiczego u chorych otrzymujących całkowite żywienie pozajelitowe (16).
Cel pracy
Celem przedstawionej pracy była analiza pokrewieństwa genetycznego oparta na technice RAPD szczepów C. albicans i C. glabrata izolowanych od chorych otrzymujących całkowite żywienie pozajelitowe.
Materiał i metody
Analiza pokrewieństwa genetycznego szczepów została przeprowadzona na 55 klinicznych izolatach grzybów drożdżopodobnych wyhodowanych od 37 chorych otrzymujących całkowite żywienie pozajelitowe. Chorzy byli hospitalizowani w Klinice Żywienia i Chirurgii Szpitala Klinicznego im. W. Orłowskiego w Warszawie. Tabela 1 przedstawia rodzaj materiału klinicznego oraz gatunki grzybów drożdżopodobnych wyhodowane z tych materiałów.
Tabela 1. Gatunki grzybów drożdżopodobnych oraz rodzaj materiału klinicznego.
| Gatunek (liczba izolatów) | Krew | Mocz | Stomia | Wymaz z odbytu | Plwocina | Wymaz z jamy ustnej | Wydzielina oskrzelowa | Wymaz z szyjki macicy |
| Candida glabrata (31) | 1 | 9 | 6 | 7 | 3 | 2 | 1 | 2 |
| Candida albicans (13) | 3 | 1 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | – |
| Candida tropicalis (3) | 1 | – | 2 | – | – | – | – | – |
| Candida parapsilosis (3) | 3 | – | – | – | – | – | – | – |
| Candida krusei (2) | – | 1 | – | – | 1 | – | – | – |
| Candida lusitaniae (2) | – | 1 | 1 | – | – | – | – | – |
| Candida inconspicua (1) | – | – | – | – | 1 | – | – | – |
| Ogółem (n = 55) | 8 | 12 | 10 | 9 | 8 | 3 | 3 | 2 |
Do analizy molekularnej wybrano dwa dominujące gatunki drożdżaków – Candida albicans (13 szczepów) oraz Candida glabrata (31 szczepów). Pozostałe pojedyncze gatunki drożdżaków (11 szczepów) nie zostały włączone do badania pokrewieństwa genetycznego.
Posiewy wykonywano z materiałów klinicznych na podłoże Sabourauda z dodatkiem chloramfenikolu i gentamycyny (bioMèrieux). Płytki z wykonanym posiewem inkubowano w 30°C przez 24-48 h. Identyfikację uzyskanych szczepów przeprowadzono przy użyciu testów ID 32C (bioMèrieux) zgodnie z zaleceniami producenta.
Izolacja DNA genomowego i badanie pokrewieństwa szczepów
Izolację DNA genomowego wykonano zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu izolacyjnego firmy EURx (Gdańsk, Polska) z trzydniowej hodowli wyizolowanych szczepów w 1,5 ml płynnego podłoża Sabourauda bez dodatku antybiotyków. Po usunięciu pozostałości pożywki komórki zostały poddane lizie enzymatycznej w buforze reakcyjnym zawierającym proteinazę K oraz rybonukleazę. Uzyskany lizat nanoszony był na kolumienki izolacyjne i przemywany dwukrotnie buforem myjącym w celu usunięcia komponentów białkowo-lipidowych. Następnie dokonano elucji DNA związanego ze złożem przy użyciu buforu Tris pH8.0. Otrzymane DNA posłużyło do przeprowadzenia dalszych etapów analiz.
Badanie pokrewieństwa szczepów Candida przeprowadzono metodą RAPD (ang. random amplified polymorphic DNA). Analiza opiera się na metodzie PCR przeprowadzanej z jednym niespecyficznym genowo starterem przy niskiej temperaturze topnienia. Reakcja prowadzona była w termocyklerze DNA Engine (MJ Research, BioRad, Hercules, USA) w warunkach 95°C-5’, 45 cykli 95°C-1’, 36°C-1’, 72°C-2’ w dwóch najliczniejszych grupach izolatów. Produkty reakcji rozdzielano elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Dla gatunku Candida glabrata użyto starteru CND1 o sekwencji 5’ TGG TCG CGG C 3’. Natomiast dla izolatów C. albicans użyto startera OPE-04 5’ GTG ACA TGC C 3’. Analizę wyników przeprowadzono przy użyciu programu GeneTools firmy Syngene (Cambridge, Wielka Brytania).
Wyniki
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Duran B: The effects of long-term total parenteral nutrition on gut mucosal immunity in children with short bowel syndrome: a systemic review. BMC Nurs 2005; 4: 1-22.
2. Dimick JB, Swoboda S, Talamini MA et al.: Risk of Colonization of Central Venous Catheters: Catheters for Total Parenteral Nutrition Vs Other Catheters. Am J Crit Care 2003; 12: 328-335.
3. Tsai CC, Lay CJ, Wang CL et al.: Prognostic factors of candidemia among nonneutropenic adults with total parenteral nutrition. Microbiol Immunol Infect 2011; 44(6): 461-466.
4. Essendoubi M, Toubas D, Lepouse C, Leon A: Epidemiological investigation and typing of Candida glabrata clinical isolates by FTIR spectroscopy. J Microbiol Methods 2007; 71: 325-331.
5. Bonfim-Mendonça Pde S, Fiorini A, Shinobu-Mesquita CS et al.: Molecular typing of Candida albicans isolates from hospitalized patients. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2013; 55(6): 385-391.
6. Mnichowska-Polanowska M, Wojciechowska-Koszko I, Klimowicz B et al.: Endogenous or exogenous origin of vaginal candidiasis in Polish women? Pol J Microbiol 2013; 2(3): 311-317.
7. Paluchowska P, Tokarczyk M, Bogusz B et al.: Molecular epidemiology of Candida albicans and Candida glabrata strains isolated from intensive care unit patients in Poland. Mem Inst Oswaldo Cruz 2014; 109(4): 436-441.
8. Pinto MP, Resende MA, Koga-Ito C, Tendler M: Genetic Variability Analysis among Clinical Candida spp. Isolates using Random Polymorphic DNA. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 2: 147-152.
9. Xavier PC, Chang MR, Paula CR et al.: Molecular characterization of Candida spp. isolates from patients with bloodstream infections. Rev Soc Bras Med Trop 2013; 46(6): 786-787.
10. Araújo Paulo de Medeiros M, Vieira de Melo AP, Gonçalves SS et al.: Genetic relatedness among vaginal and anal isolates of Candida albicans from women with vulvovaginal candidiasis in north-east Brazil. J Med Microbiol 2014; 63: 1436-1445.
11. Bautista-Munoz C, Boldo XK, Villa-Tanaca L, Hernandez-Rodriguez C: Identification of Candida spp. by Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis and differentation between Candida albicans and Candida dubliniensis by direct PCR methods. J Clin Microb 2003; 1: 414-420.
12. Issa SY, Badran EF, Aqel KF, Shehabi AA: Epidemiological characteristics of Candida species colonizing oral and rectal sites of Jordanian infants. BMC Pediatr 2011; 11: 79.
13. Valerio HM, Botelho Weikert-Oliviera R: Differentation of Candida species obtained from nonsocomial candidemia using RAPD- PCR technique. Rev Soc Bras Med Trop 2006; 2: 1-9.
14. da Costa KR, Ferreira JC, Lavrador MA et al.: Virulence attributes and genetic variability of oral Candida albicans and Candida tropicalis isolates. Mycoses 2012; 55(3): e97-e105.
15. Golas M, Netsvyetayeva I, Piskorska K et al.: Polymerase chain reaction melting profiles of Candida glabrata clinical isolates in solid organ transplant recipients in comparison to the other group of surgical patients. Transplant Proc 2014; 46(5): 1366-1370.
16. Marais E, Steward R, Duse AG et al.: Candida parapsilosis detected in TPN using the BactT/Alert system and characterized by randomly amplified polymorphic DNA. J Hosp Infec 2004; 56: 291-296.
17. Chong PP, Abdul Hadi SR, Lee YL et al.: Genotyping and drug resistance profile of Candida spp. in recurrent and one-off vaginitis, and high association of non-albicans species with non-pregnant status. Infect Genet Evol 2007; 7: 449-456.
18. Boldo XM, Villa-Tanaca L, Zúñiga G, Hernández-Rodríguez C: Genetic diversity among clinical isolates of Candida glabrata analyzed by randomly amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis analyses. J Clin Microbiol 2003; 41: 4799-4804.
