© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2016, s. 119-124
*Urszula Czyżewska, Wojciech Miltyk
Spektrometria mas w analizie składu propolisu
Mass spectrometry in analysis of chemical composition of propolis
Samodzielna Pracownia Analizy Leków, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Kierownik Pracowni: dr hab. n. farm. Wojciech Miltyk
Summary
Propolis is a honeybee product with a very complex chemical composition and a wide spectrum of pharmacological properties. The majority of propolis studies focus on the chemical composition of ethanolic extract of propolis (EEP) and its main polyphenols constituents such as flavonoids, chalcones, aromatic acids and its derivatives, terpenes, phenyl propanoids. Analysis of such complicated matrix requires implying analytical techniques capable to identify wide range of compounds with diverse physicochemical properties. Development of chromatographic and mass spectrometric methods enabled to determine variety of constituents of propolis.
This paper reviews present literature devoted to qualitative and quantitative analysis of propolis extracts by separation techniques coupled to mass spectrometry. The most frequently used types of analyzers and ionization techniques have been described according to their suitability for evaluation of propolis composition. The review summarizes the employment of GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) and LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry) in the recent 12 years in analysis of the main flavonoids (pinocembrin, pinobanksin, chrysin, galangin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin, apigenin) and cinnamic acids (ferulic, caffeic, p-coumaric) in propolis extracts.
Ostatnie dziesięciolecie było okresem gwałtownego rozwoju i zmian aparatury do spektrometrii mas (MS), które zwiększyły możliwości identyfikacyjne metod spektrometrycznych w różnych dziedzinach nauki. Najbardziej przydatne stały się jednak sprzężenia spektrometrów mas z niektórymi rodzajami chromatografów, takie jak chromatograf gazowy (GC-MS) lub chromatograf cieczowy (LC-MS). Połączenie układów GC-MS i LC-MS pozwoliło na stworzenie większych możliwości identyfikacyjnych wielu związków, poprzez wykorzystanie dodatkowo parametrów chromatograficznych, takich jak czas retencji oraz wyliczony eksperymentalnie indeks retencji (1, 2).
Propolis oraz wytworzone z niego produkty charakteryzują się bogatym składem chemicznym. Liczne badania wskazują na obecność około 300 składników, z czego około 240 zostało zidentyfikowanych głównie za pomocą technik rozdzielczych połączonych ze spektrometrią mas (3-6). Analiza składu chemicznego propolisu wykazała obecność różnych grup związków chemicznych. Do najczęściej identyfikowanych należą związki polifenolowe: flawonoidy, chalkony, kwasy aromatyczne oraz ich estry, terpeny, fenylopropanoidy, stilbeny oraz lignany (2, 5, 7-9). Różnorodność składu chemicznego propolisu uwarunkowana jest rodzajem szaty roślinnej w miejscu zbioru oraz gatunkiem pszczół zbierających ten produkt (10-15). W Polsce i innych krajach europejskich głównymi składnikami propolisu są żywice (eksudaty) wydzielane przez pączki topoli czarnej (Populus nigra), topoli osiki (P. tremula) i brzozy brodawkowatej (Betula verrucosa) (15, 16).
Identyfikowanie składników tak różnorodnej mieszaniny związków jak propolis jest złożonym zadaniem badawczym. Dzięki połączeniu obu uzupełniających się technik – chromatografii i spektrometrii mas – możliwym stała się identyfikacja struktur związków chemicznych wraz z ich analizą ilościową. Chromatograf rozdziela złożoną mieszaninę na pojedyncze składniki, dostarczając parametrów chromatograficznych zarówno jakościowych, jak i ilościowych. Z kolei spektrometria mas pozwala na określenie budowy strukturalnej badanych cząsteczek (17).
Idea spektrometrii mas jest oparta na wytworzeniu jonów oznaczanego związku chemicznego, a następnie na rozdziale utworzonych jonów w zależności od stosunku ich masy do ładunku (m/z) oraz detekcji. W związku z tym, możliwości stosowanego układu spektrometrycznego są zależne od trzech komponentów: źródła jonów, analizatora mas oraz detektora.
Źródła jonów
Generowanie jonów jest procesem, który ma duże znaczenie w zakresie jakości uzyskiwanych danych spektroskopowych. Wybór zastosowanej metody jonizacji zależny jest od właściwości fizykochemicznych oznaczanych związków (lotności, masy cząsteczkowej, stabilności termicznej) oraz stopnia złożoności matrycy, w ramach której jest analizowany (18). Metody jonizacji możemy podzielić na dwie grupy: te, które zachodzą w fazie gazowej, i pozostałe, które służą do jonizacji niskolotnych i wielkocząsteczkowych związków. Pierwsza grupa obejmuje jonizację elektronową (EI) i jonizację chemiczną (CI) – najbardziej rozpowszechnione sposoby jonizacji, które znalazły zastosowanie w systemach GC-MS. Wymienione metody są wykorzystywane do jonizacji związków wykazujących nawet nieznaczną prężność par przy ciśnieniu około 10-6 tora i jednocześnie charakteryzujących się trwałością w temperaturze parowania (1). Do drugiej grupy możemy zaliczyć ewaporacyjne sposoby jonizacji: termorozpylanie (TE), elektrorozpylanie (ESI), jonizację chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) oraz oparte na desorpcji próbki: bombardowanie szybkimi atomami (FAB) czy desorpcję laserową z udziałem matrycy (MALDI). Desorpcyjne metody jonizacji są technikami, w których substancje są bezpośrednio emitowane w postaci jonów z powierzchni fazy skondensowanej do fazy gazowej.
Jonizacja strumieniem elektronów (EI) jest najstarszą i najczęściej stosowaną metodą w rutynowych analizach małocząsteczkowych, hydrofobowych i stabilnych termicznie cząsteczek (19). Z przeglądu piśmiennictwa wynika, że jest to najczęściej stosowana metoda jonizacji w analizie próbek propolisu (tab. 1) w połączeniu z chromatografią gazową. Cząsteczki próbki w fazie gazowej są bombardowane elektronami o energii 70 eV, które następnie wybijają elektron z cząsteczki, tworząc kationorodnik M[sup]+· nazywany jonem molekularnym (1). Nadmiar energii elektronów zostaje zużyty na zrywanie kolejnych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce. Jonizacja elektronowa jest nazywana „twardą” ze względu na generowanie licznych jonów fragmentacyjnych. Zaletą metody EI jest otrzymywanie wysoce powtarzalnych i charakterystycznych dla analizowanych związków widm mas. Przewidywalność procesu fragmentacji badanych związków jest podstawą do pełnego określania struktur za pomocą spektrometrii mas. Z kolei powtarzalność tego procesu przyczyniała się do powstania i ciągłego rozbudowywania baz danych, zawierających widma masowe, które zwiększają możliwości identyfikacyjne, m.in. w analizie składu propolisu.
Tab. 1. Przegląd metod oznaczania niektórych składników propolisu
| Oznaczane związki | Jonizacja | Rozdział chromatograficzny i detekcja | Piśmiennictwo |
| Kwas p-kumarowy | EI | GC-MS | (2, 8, 28-31) |
| ESI, APCI | LC-MS-MS, HPLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (20, 21, 24, 25, 32, 33) |
| Kwas ferulowy | EI | GC-MS | (2, 8, 29-31) |
| ESI, APCI | LC-MS-MS, LC-Q-ToF, HPLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (20, 21, 24, 25, 34, 35) |
| Kwas kawowy | EI | GC-MS | (2, 8, 29-31) |
| ESI, APCI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, LC-Q-ToF, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (21, 24, 25, 32-35) |
| Ester fenyloetylowy kwasu kawowego (CAPE) | EI | GC-MS | (2, 30) |
| ESI | LC-MS-MS, HPLC-MS | (20, 21) |
| Pinocembryna | EI | GC-MS | (2, 29-31) |
| ESI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (20, 21, 24, 32, 33, 35) |
| Pinobanksyna | EI | GC-MS | (2, 29-31) |
| ESI, APCI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (21, 24, 25, 32, 33, 35) |
| Chryzyna | EI | GC-MS, GCxGC-ToF-MS | (8, 27, 28, 30, 31) |
| ESI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (20, 21, 24, 32, 33) |
| Galangina | EI | GC-MS | (2, 30, 31) |
| ESI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (21, 24, 32, 33) |
| Kwercetyna | EI | GCxGC-ToF-MS | (8, 28) |
| ESI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, HPLC-IT | (20, 21, 24, 32) |
| Kemferol | EI | GC-MS | (8, 30) |
| ESI, APCI | LC-MS-MS, HPLC-MS, HPLC-IT | (21, 24, 25) |
| Izoramnetyna | EI | GC-MS, GCxGC-ToF-MS | (28, 29) |
| ESI | LC-MS-MS, HPLC-IT | (21, 24) |
| Apigenina | EI | GC-MS, GCxGC-ToF-MS | (2, 8, 28-30) |
| ESI | LC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT | (21, 24, 32, 33) |
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Silverstein RM, Webster FX, Kiemle DJ. Spectrometric identification of organic compounds. PWN, Warszawa 2007; 1-13. 2. Czyżewska U, Konończuk J, Teul J i wsp. Verification of chemical composition of commercially available propolis extracts by gas chromatography-mass spectrometry analysis. J Med Food 2015; 18:584-91. 3. Bankova VS, Castro SL, Marcucci MC. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 2000; 31:3-15. 4. Guo S, Fu S, Shen Z i wsp. Chemical composition, biological activity and application in animal science of propolis – a review. Adv Biomed Engin 2011; 98-101. 5. Huang S, Zhang C-P, Wang K i wsp. Recent advances in the chemical composition of propolis. Molecules 2014; 19:19610-32. 6. Toreti VC, Sato HH, Pastore GM i wsp. Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin. Evid Based Complement 2013; 2013:Article ID 697390, 13 pages. 7. Abu-Mellal A, Koolaji N, Duke RK i wsp. Prenylated cinnamate and stilbenes from Kangaroo Island propolis and their antioxidant activity. Phytochem 2012; 77:251-9. 8. Aliboni A, D’Andrea A, Massanisso P. Propolis specimens from different locations of central Italy: chemical profiling and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) quantitative analysis of the allergenic esters benzyl cinnamate and benzyl salicylate. J Agric Food Chem 2011; 59:282-8. 9. Fernandes-Silva CC, Salatino A, Salatino MLF i wsp. Chemical profiling of six samples of brazilian propolis. Quimica Nova 2013; 36:237-40. 10. Valencia D, Alday E, Robles-Zepeda RA i wsp. Seasonal effect on chemical composition and biological activities of Sonoran propolis. Food Chem 2012; 131:645-51. 11. Guo X, Chen B, Luo L i wsp. Chemical compositions and antioxidant activities of water extracts of Chinese propolis. J Agric Food Chem 2011; 59:12610-6. 12. Salatino A, Fernandes-Silva CC, Righi AA i wsp. Propolis research and the chemistry of plant products. Nat Prod Rep 2011; 28:925-36. 13. Christov R, Trusheva B, Popova M i wsp. Chemical composition of propolis from Canada, its antiradical activity and plant origin. Nat Prod Res 2006; 20:531-6. 14. Gardjeva PA, Dimitrova SZ, Kostadinov ID i wsp. A study of chemical composition and antimicrobial activity of Bulgarian propolis. Folia Med 2007; 49:63-9. 15. Maciejewicz W, Daniewski M, Dzido TH i wsp. GC-MS and HPLC analysis of phenolic acids extracted from propolis and from Populus nigra bud exudate. Chem Anal 2002; 47:21-30. 16. Kędzia B. Pochodzenie propolisu w świetle teorii i badań naukowych. Herba Pol 2008; 54:179-86. 17. Johnstone RAW, Rose ME. Spektrometria mas. Wyd Nauk PWN, Warszawa 2001; 56-103, 131-69. 18. Lavagnini I, Magno F, Seraglia R i wsp. Quantitative application of mass spectrometry. John Wiley & Sons LTD, Atrium, Chichester 2006; 1-35. 19. Siuzdak G. The expanding role of mass spectrometry in biotechnology. MCC Press San Diego 2006; 1-48. 20. Falcao SI, Vale N, Gomes P i wsp. Phenolic profiling of Portuguese propolis by LC-MS spectrometry: uncommon propolis rich in flavonoid glycosides. Phytochem Anal 2013; 24:309-18. 21. Gardana C, Scaglianti M, Pietta P i wsp. Analysis of the polyphenolic fraction of propolis from different sources by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal 2007; 45:390-9. 22. Ristivojevic P, Trifkovic J, Gasic U i wsp. Ultrahigh-performance liquid chromatography and mass spectrometry (UHPLC-LTQ/Orbitrap/MS/MS) study of phenolic profile of Serbian poplar type propolis. Phytochem Anal 2015; 26:127-36. 23. Nunes CA, Guerreiro MC. Characterization of Brazilian green propolis throughout the seasons by headspace GC/MS and ESI-MS. J Sci Food Agric 2012; 92:433-8. 24. Pellati F, Orlandini G, Pinetti D i wsp. HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS/MS methods for metabolite profiling of propolis extracts. J Pharm Biomed Anal 2011; 55:934-48. 25. Chang R, Pilo-Veloso D, Morais SAL i wsp. Analysis of a Brazilian green propolis from Baccharis dracunculifolia by HPLC-APCI-MS and GC-MS. Braz J Pharmacogn 2008; 18:549-56. 26. Marquez-Hernandez I, Cuesta-Rubio O, Campo-Fernandez M i wsp. Studies on the constituents of yellow Cuban propolis: GC-MS determination of triterpenoids and flavonoids. J Agric Food Chem 2010; 58:4725-30. 27. Choudhari MK, Punekar SA, Ranade RV i wsp. Antimicrobial activity of stingless bee (Trigona sp.) propolis used in the folk medicine of Western Maharashtra. J Ethnopharmacol 2012; 141:363-7. 28. Gao X, Williams SJ, Woodman OL i wsp. Comprehensive two-dimensional gas chromatography, retention indices and time-of-flight mass spectra of flavonoids and chalcones. J Chromatogr A 2010; 1217:8317-26. 29. Isidorov VA, Szczepaniak L, Bakier S. Rapid GC/MS determination of botanical precursors of Eurasian propolis. Food Chemistry 2014; 142:101-6. 30. Markiewicz-Zukowska R, Car H, Naliwajko SK i wsp. Ethanolic extract of propolis, chrysin, CAPE inhibit human astroglia cells. Adv Med Sci 2012; 57:208-16. 31. Popova M, Silici S, Kaftanoglu O i wsp. Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition. Phytomed 2005; 12:221-8. 32. Morlock GE, Ristivojevic P, Chernetsova ES i wsp. Combined multivariety data analysis of high-performance thin-layer chromatography fingerprints and direct analysis in real time mass spectra for profiling of natural products like propolis. J Chromatogr A 2014; 1328:104-12. 33. Szliszka E, Sokol-Letowska A, Kucharska AZ i wsp. Ethanolic extract of Polish propolis: chemical composition and TRAIL-R2 death receptor targeting apoptotic activity against prostate cancer cells. Evid Based Complement 2013; 2013:Aritcle ID 757628, 12 pages. 34. Restivo A, Degano I, Ribechini E i wsp. Development and optimisation of an HPLC-DAD-ESI-Q-ToF method for the determination of phenolic acids and derivatives. Plos One 2014; 9:e88762. 35. Kasote D, Ahmad A, Chen W i wsp. HPTLC-MS as an efficient hyphenated technique for the rapid identification of antimicrobial compounds from propolis. Phytochem Lett 2015; 11:326-31. 36. Witkiewicz Z, Kałużna-Czaplińska J. Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych. WNT, Warszawa 2012:119-32.
