© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 7-8/2007, s. 309-314
*Joanna Kopeć-Szlęzak1, Urszula Podstawka1, Anna Sikorska2, Agnieszka Gajewska1, Lech Konopka2
Znaczenie CD38 i ZAP-70 jako czynników rokowniczych w przewlekłej białaczce limfocytowej B (PBL-B)*
CD38 and ZAP-70 as prognostic factors in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL)
1Zakład Cytobiologii Hematologicznej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Joanna Kopeć-Szlęzak
2Klinika Chorób Wewnętrznych i Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Lech Konopka
Streszczenie
Wstęp i cel pracy. Czynniki rokownicze w przewlekłej białaczce limfocytowej B (PBL-B) oparte są na wskaźnikach biologicznych komórek białaczkowych B; są to m.in. ekspresja CD38 oraz ekspresja cytoplazmatycznej kinazy ZAP-70. Celem naszych badań było przeprowadzenie analizy ekspresji CD38 i ZAP-70 u chorych na PBL-B pod względem: a) proporcji chorych CD38+ i CD38- oraz ZAP-70+ i ZAP-70- w okresie rozpoznania, b) równoczesnego występowania CD38 i ZAP-70 w komórkach B PBL-B oraz c) „losów” chorych na PBL-B w zależności od ekspresji CD38.
Materiał i metody. Materiałem badawczym była krew obwodowa 90 chorych z rozpoznaną rutynowo PBL-B, u których oznaczano na komórkach białaczkowych B ekspresję CD38, a u 33 osób oznaczono równolegle cytoplazmatyczną kinazę ZAP-70. Zastosowano metody cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał monoklonalnych.
Wyniki i wnioski. Analiza ekspresji CD38 wykazała, że 22% chorych (z 90) było CD38 dodatnich, a odsetek komórek białaczkowych B CD38+ wahał się od 30 do 92. U 44% chorych stwierdzono w komórkach białaczkowych B obecność kinazy ZAP-70, a odsetek komórek ZAP-70+ wynosił od 21 do 84. Wśród 33 chorych stwierdzono 15% osób z jednoczesną ekspresją CD38 i ZAP-70 oraz 48% osób bez ekspresji CD38 i ZAP-70. Analiza kliniczna 30 chorych w okresie co najmniej rok od rozpoznania PBL-B wykazała, że z 10 osób CD38+ żyją 3 osoby, a z grupy 20 osób CD38-negatywnej żyje 12 osób (stadium 0/II wg Rai). Ekspresja CD38 i ZAP-70 u chorych na PBL-B jest nie zawsze równoległa, ale stanowi uznany czynnik rokowniczy przebiegu PBL-B i ich oznaczanie może być przydatne w badaniach rutynowych.
Summary
Introduction and the aim of study. Prognostic factors in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) are based on biological parameters of leukemic B cells, such as expression of CD38 and cytoplasmic kinase ZAP-70.
The aim of our study was to determine CD38 and ZAP-70 expression on B-cells in patients suffering from B-CLL: a) designation of CD38+ and CD38- and ZAP-70+ and ZAP-70- groups of patients at the moment of diagnosis, b) disclosure of CD38 and ZAP-70 expression concordance, c) prognostic prediction for CD38+ and CD38- groups of patients.
Material and methods. Leucocytes from peripheral blood of 90 B-CLL patients were studied. Expression of CD38 on B-leukemic cells was studied in all samples, and expression of ZAP-70 was determined in 33 samples. Multiparametric flow cytometry and monoclonal antibodies were used for determination of antigen expression.
Results and conclusions. 22% of B-CLL patients were CD38-positive, and range of CD38 expression on B-cells was 30% up to 92%. 44% of B-CLL patients were ZAP-70-positive, the range of ZAP-70 expression on B-cells was 21% up to 84%. Combined analysis of CD38 and ZAP-70 was performed on B-CLL cells of 33 patients and revealed: synchronous expression of both antigens in 15% cases, 48% patients were concordantly negative. Clinical analysis of 30 cases after one year revealed: 3/10 CD38+ patients are still alive, and in CD38-negative group 12/20 patients (Rai st. 0/II) are alive. CD38 expression was associated with faster progression of disease. CD38 and ZAP-70 expression, not always synchronous, seems to be a useful prognostic tool in B-CLL patients.
Wstęp
Zróżnicowanie przebiegu klinicznego przewlekłej białaczki limfocytowej B (PBL-B) stwarza potrzebę poszukiwania czynników rokowniczych. Aktualnie uznawane czynniki prognostyczne we wczesnych stadiach klinicznych oparte są na parametrach biologicznych komórek białaczkowych B takich, jak stan genów kodujących części zmienne łańcucha ciężkiego Ig, aberracje genowe, a także ekspresja CD38 na powierzchni komórek B oraz ekspresja cytoplazmatycznej kinazy ZAP-70 (Zeta Associated Protein 70 kDa) (1, 2, 3).
Wiele dyskusji wzbudza celowość stosowania ZAP-70 jako „zastępczego” określania zmutowanej (ZAP-ujemna) lub niezmutowanej (ZAP-dodatnia) postaci PBL-B (4, 5, 6). Tzw. niezmutowana forma PBL-B charakteryzuje się gorszym rokowaniem, a odsetek takich chorych określany jest na około 40% wszystkich badanych przypadków PBL-B (1, 7). Ekspresja ZAP-70 stwierdzona na początku choroby jest niezmienna w czasie jej trwania, a obecność ZAP -70 wiąże się ze zwiększoną aktywnością sygnalizacyjną zachodzącą poprzez receptor BCR (5) oraz wzrostem aktywności sygnalizacyjnej molekuły CD38 w komórkach białaczkowych PBL-B (4). ZAP-70 można oznaczać metodą PCR, a także przy pomocy cytometrii przepływowej, która to metoda obecnie podlega standaryzacji m.in. we Francji (8).
Ekspresja CD38 jest uznawana za przydatny czynnik rokowniczy w PBL-B, choć jej poziom może ulegać wahaniom w przebiegu choroby (3, 9, 10). Według niektórych autorów (11,12) jest to czynnik związany ze stanem mutacji Ig(V)H. Morabito i wsp. (13) sugerują, że ekspresja CD38 jest przejawem stanu aktywności komórek białaczkowych B, i polega m.in. na kontroli drogi sygnalizacyjnej prowadzącej do proliferacji i tym samym zwiększenia agresywności przebiegu PBL-B. Grupę chorych CD38+ cechuje większa aktywność telomerazy i wyższy odsetek komórek pozytywnych dla markera Ki-67, znakującego komórki proliferujące. Z piśmiennictwa ostatnich lat wiadomo także, że charakter ekspresji CD38 i ZAP-70 nie przebiega równolegle u tych samych chorych, ale niektórzy badacze uważają, że ekspresja CD38 i ZAP-70 stanowi uzupełniające się czynniki rokownicze w PBL (1, 14).
Celem naszych badań było przeprowadzenie analizy ekspresji CD38 i ZAP-70 u chorych na PBL-B w trzech aspektach: a) określenia proporcji chorych, u których w okresie rozpoznania występowały limfocyty B CD38+ oraz ZAP-70+, b) równoczesnego występowania ekspresji CD38 i ZAP-70 w komórkach białaczkowych PBL-B oraz c) „losów” chorych na PBL-B w zależności od ekspresji CD38 na komórkach białaczkowych B w okresie rozpoznania.
Materiał i metody
Materiał badawczy stanowiła krew obwodowa 90 chorych na PBL-B w czasie rozpoznania choroby, u których w sposób rutynowy stwierdzono PBL-B. Chorzy (39 kobiet i 51 mężczyzn) wykazywali w przeważającej części zaawansowanie kliniczne 0/II wg Rai (80% chorych). Ekspresję CD38 na komórkach białaczkowych B (CD19+CD5+) analizowano metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego anty-CD38FITC (DAKO). Obecność kinazy tyrozynowej ZAP-70 oznaczano w komórkach białaczkowych B (u 33 chorych) przy pomocy zestawu Fix & Perm kit oraz przeciwciała anty ZAP-70PE i kontroli firmy (Caltag Laboratories), zgodnie z zaleceniami piśmiennictwa (2). Wyniki odczytywano w cytometrze przepływowym FACS CANTO BD. Za próg pozytywnej ekspresji CD38 u chorego przyjęto wartość 30% komórek białaczkowych B CD38+ (1), a w przypadku ZAP-70 – 20% komórek B (4). Ponadto dokonano analizy stanu klinicznego 30 chorych na PBL-B, po upływie co najmniej roku od rozpoznania. W opracowaniu wyników badań stosowano oznaczenie wskaźnika intensywności ekspresji molekuły CD38 (RFI – Relative Fluorescence Intensity) (15) oraz test korelacji wg Pearsona.
Wyniki
Ekspresja CD38
Stwierdzono, że chorzy z ekspresją CD38 powyżej przyjmowanego w piśmiennictwie „pozytywnego” progu (30%) na komórkach białaczkowych CD19+CD5+ stanowili 22% z liczby 90 przebadanych chorych. Odsetek limfocytów białaczkowych B CD38+ u poszczególnych chorych wahał się w granicach od 34 do 92. Połowa chorych nie wykazywała praktycznie ekspresji CD38 (poniżej 5% komórek B CD38+). Natomiast u 25 osób (28%) ekspresja CD38 na komórkach białaczkowych B występowała na 5% do 30% komórek, czyli była niższa od przyjmowanej wartości progowej występowania komórek z tym antygenem.
Analiza intensywności ekspresji CD38 na komórkach B CD38+ (oznaczana przy pomocy wskaźnika RFI) u chorych z ekspresją co najmniej 5% limfocytów B CD38+ wykazała dodatnią korelację pomiędzy wartością odsetka komórek B CD38+ a poziomem intensywności tej ekspresji (współczynnik korelacji r=0,32, p=0,03). Oznacza to, że wyższej wartości odsetka limfocytów B CD38+ towarzyszy większa intensywność ekspresji molekuły CD38 na poszczególnych komórkach białaczkowych B. Wśród chorych z limfocytami B CD38+ w okresie klinicznego zaawansowania choroby 0/II wg Rai znajdowało się 9 osób, a w okresie III/IV – 18 chorych. Chorzy z limfocytami B CD38- wykazywali głównie 0/II wg Rai okres zaawansowania klinicznego.
Stan kliniczny chorych z limfocytami B CD38+
i chorych z limfocytami B CD38-
W roku 2006 ustalono, że spośród 10 osób z obecnością limfocytów B CD38+ 7 chorych zmarło, a u jednego chorego doszło do progresji choroby (zaawansowanie IVa wg Rai), zaś dwóch pacjentów pozostaje nadal w okresie zaawansowania klinicznego IIa. Z grupy chorych z limfocytami CD38 ujemnymi 8 osób zmarło, a z 12 nadal żyjących pacjentów 11 pozostaje w tym samym okresie choroby (tj. 0/IIa), jaki stwierdzono przy rozpoznaniu PBL-B.
Ekspresja ZAP-70 w komórkach PBL-B
Spośród 33 chorych, u których oznaczano ZAP-70, obecność komórek B ZAP-70+ potwierdzono tylko u 13 osób (40% chorych). Dwóch chorych wykazywało wysoki odsetek komórek B ZAP-70 dodatnich (ponad 70% i 80%); u pozostałych chorych odsetek komórek B ZAP-70+ wynosił od 21 do 39, a średnia wartość odsetka komórek białaczkowych B wyniosła 35.
Ocena ekspresji ZAP-70 w porównaniu z ekspresją CD38 wykazała, że oba znaczniki występują równocześnie w limfocytach B tylko u 5 chorych (15% badanych) (ryc. 1).
Ryc. 1. Limfocyty B w krwi obwodowej chorego na PBL-B o immunofenotypie CD38+ZAP-70+. A- cytogram przedstawiający białaczkowe limfocyty B; B – histogram pokazujący ekspresję CD38 na limfocytach białaczkowych B, C – histogram pokazujący ekspresję kinazy ZAP-70 w komórkach białaczkowych B.
Natomiast u 16 chorych limfocyty B były CD38 ujemne i nie wykazywały ekspresji ZAP-70 (48%). Stwierdzono również, że u 8 chorych z limfocytami B ZAP-70+ nie występowała ekspresja CD38 (około 25%), zaś 4 chorych, u których komórki B nie wykazywały obecności ZAP-70 obecna była ekspresja CD38. Połowa chorych ZAP70+ znajdowała się w grupie charakteryzującej się obecnością od 5 do 30% komórek B CD38+. Szczegółowe dane przedstawia tabela 1.
Tabela 1. Analiza ekspresji molekuł uznanych za czynniki rokownicze w przewlekłej białaczce limfocytowej B.
B. Ekspresja kinazy ZAP-70 w komórkach białaczkowych B o różnej ekspresjiCD38.
| | Limfocyty B z CD38>30% | Limfocyty B z CD38 5-30% | Limfocyty B z CD38<5% |
| %CD38 z CD19 | leukocytoza | %CD38 z CD19 | leukocytoza | %CD38 z CD19 | leukocytoza |
| Średnia | 65,3 | 119 570 | 14,7 | 61 630 | 1,2 | 47 430 |
| SD | 19,3 | 158 290 | 7,6 | 65 600 | 1,0 | 47 720 |
| mediana | 62,2 | 52 500 | 13,2 | 33 230 | 1,0 | 28 600 |
| min | 33,8 | 15 000 | 5,5 | 12 000 | 0,1 | 10 400 |
| max | 92,4 | 630 000 | 28,8 | 256 800 | 3,9 | 257 000 |
A. Ekspresja antygenu powierzchniowego CD38 na limfocytach białaczkowych B.
| | n | Liczba chorych ZAP-70 dodatnich | %chorych ZAP-70 dodatnich | Średni %limf.B ZAP-70+ u chorych ZAP-70 dodatnich | Min. | Max. | Średni % kom.ZAP-70+wśród kom. CD19+ |
| chorzy >30% kom.CD38+ | 6 | 2 | 33,3 | 30,2 | 28,8 | 31,6 | 12,9 |
| chorzy 5%-30% kom.CD38+ | 13 | 7 | 53,8 | 34,9 | 21,2 | 84,1 | 22,8 |
| chorzy < 5% kom. CD38+ | 14 | 4 | 28,6 | 40,7 | 24 | 72,8 | 15,9 |
Dyskusja
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Schroers R., et al.: Combined analysis of ZAP-70 and CD38 expression as a predictor of disease progression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2005; 19:750-8.
2. Del Principe M.I., et al.: Clinical significance of ZAP-70 protein expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2006; 108: 853-61.
3. Hayat A., et al.: CD38 expression level and pattern of expression remains a reliable and robust marker of progressive disease in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 2006; 47: 2371-9.
4. Richardson S., et al.: ZAP-70 expression is associated with enhanced ability to respond to migratory and survival signals
in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). Blood 2006; 107: 3584-3592.
5. Chen Y.H., et al.: Comparative analysis of flow cytometric techniques in assessment of ZAP-70 expression in relation to IgVH mutational status in chronic lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol. 2007; 127: 182-91.
6. Munoz L., et al.: Comparative analysis of ZAP-70 expression and IgVH mutational status in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cytometry B. Clin. Cytom. 2007; 72: 96-102.
7. Kim S.Z., et al.: Expression of ZAP-70 protein correlates with disease stage in chronic lymphocytic leukemia and is associated with, but not generally restricted to, non-mutated IgVH status. Leuk Lymphoma. 2004; 45: 2037-45.
8. Le Garff-Tavernier M., et al.: National standardization of ZAP-70 flow cytometry determination: the French experience. Cytometry B. Clin. Cytom., 2007; 72: 103-8.
9. Durig J., et al.: CD38 is an important prognostic marker in CLL. Leukemia 2002; 16: 30-35.
10. Ghia P., et al.: CD38 modifications in chronic lymphocytioc leukemia: are the relevant? Leukemia 2004; 18: 1733-1735.
11. Damle R., et al.: Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999, 94, 1840-1847.
12. Hamblin T., et al.: Unmutated Ig VH genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94: 1848-1854.
13. Morabito F., et al.: The CD38 ectoenzyme family: aAdvances in basic science and clinical practice. Mol. Med., 2006; 12: 342-344.
14. Hus I., et al.: The clinical significance of ZAP-70 and CD38 expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Ann. Oncol., 2006; 17: 683-690.
15. Kopeć-Szlęzak J., et al.: The analysis of L-selectin expression intensity (CD62L) on B-lymphocytes in a B-cell chronic lymphocytic leukemia cells (B-CLL). Centr. Europ. Immunol. J., 2003; 28: 105-109.
16. Boonstra J.G., et al.: CD38 as a prognostic factor in B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL): Comparison of three approaches to analyze its expression. Cytometry B. Clin. Cytom., 2006; 70: 136-141.
17. Jacob A., et al.: Retrospective analysis of CD38 expression in 102 patients with B-CLL with a maximum follow-up of 18 years: incidence and prognostic significance. Oncologie. 2006;29: 437-41.
18. Del Giudice I., et al.: Zeta chain associated protein 70 and CD38 combined predict the time to first treatment In patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2005; 104: 2124-2132.
19. Zanotti R., et al.: ZAP-70 expression, as detected by immunochemistry on bone marrow biopsies from early-phase CLL patients, is a strong adverse prognosis factor. Leukemia 2007; 21: 102-109.
20. Deaglio S., et al.: In-tandem insight from basic science combined with clinical research: CD38 as both marker and key component of the pathogenetic network underlying chronic lymphocytic leukemia. Blood 2006; 108: 1135-1144.
21. Stevenson G.: CD38 as a therapeutic target. Mol. Med., 2006; 12: 345-346.
22. Buhl A., et al.: CLLU1 expression level predict time to initiation of therapy and overall survival in chronic lymphocytic leukemia. Eur. J. Haematol., 2006; 76: 455-461.
23. Oppezzo P., et al.: The LPL/ADAM29 expression ratio is a novel prognosis indicator in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2005; 106: 650-657.
24. Rassenti L., et al.: ZAP-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression in chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med., 2004, 351: 893-901.
25. Binet J., et al.: Perspectives on the use of new diagnostic tools in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Blood 2006; 107: 859-861.
26. O´Brien S.: Update on Lymphoma menagement: chronic lymphocytic leukemia. Clinical Care Options Oncology, 2005, 47.
27. Kopeć-Szlęzak J., i wsp.: Ekspresja CD38 i CD25 na limfocytach białaczkowych B białaczkowych w przewlekłej białaczce limfocytowej B (PBL-B). Acta Haematol. Pol., 2005; 36: suppl. 2, 173-174.
