*Marek Wójcik, Edyta Czekuć-Kryśkiewicz, Barbara Parafiniuk, Ewa Skorupa, Alina Kępka, Paweł Płudowski
Porównanie komercyjnych automatycznych i manualnych metod oznaczania stężenia 25(OH)D oraz 1,25(OH)2D – doświadczenia laboratorium szpitala pediatrycznego uczestniczącego w międzynarodowym systemie kontroli jakości DEQAS
Comparison of commercially available automated and manual 25(OH)D and 1,25(OH)2D assays – experience of pediatric hospital laboratory participating in DEQAS proficiency testing
Zakład Biochemii, Radioimmunologii i Medycyny Doświadczalnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. med. Roman Janas
Streszczenie
Wstęp. Niedobór organizmu w witaminę D wiąże się ze wzrostem ryzyka rozwoju wielu chorób, w tym autoimmunologicznych, układu sercowo-naczyniowego, nowotworów, cukrzycy. Stężenie 25(OH)D w surowicy krwi stanowi wskaźnik zaopatrzenia organizmu w witaminę D. Biologicznie czynny metabolit witaminy D – 1,25(OH)2D, jest jednym z głównych czynników regulujących metabolizm wapnia i fosforu.
Cel pracy. Porównanie metod oznaczania stężenia 25(OH)D (automatycznych CLIA na analizatorach IDS-iSYS i LIAISON) oraz 1,25(OH)2D (półautomatycznej CLIA na analizatorze IDS-iSYS i manualnej RIA) w surowicy krwi w materiale pediatrycznym oraz kontroli jakości DEQAS.
Materiał i metody. Określono: 1. powtarzalność i odtwarzalność metody CLIA oznaczania stężeń 25(OH)D i 1,25(OH)2D na analizatorze IDS-iSYS w materiale pediatrycznym, 2. dokładność metody CLIA oznaczeń stężeń 25(OH)D na analizatorze IDS-iSYS w materiale kontroli jakości DEQAS w odniesieniu do metod HPLC i LC-MS/MS, 3. porównano metodę CLIA pomiaru stężeń 25(OH)D i 1,25(OH)2D na analizatorze IDS-iSYS z metodami odpowiednio: automatyczną CLIA na analizator LIAISON oraz manualną RIA.
Wyniki. Metody CLIA pomiaru stężenia 25(OH)D i 1,25(OH)2D na analizatorze IDS-iSYS charakteryzowały się wysoką powtarzalnością (odpowiednio 2,6 i 6,4%) i odtwarzalnością (odpowiednio 9,1 i 9,6%) oznaczeń. Odnotowana różnica pomiędzy oznaczeniami stężenia 25(OH)D wykonywanymi w systemach LIAISON i IDS-iSYS w materiale pediatrycznym (bias 25,7%) oraz materiale kontrolnym DEQAS (bias 49,4%) może wynikać z różnic w specyficzności testów względem metabolitów witaminy D. Porównanie metod pomiaru stężeń 1,25(OH)2D wykazało ich dobrą zgodność w materiale pediatrycznym (bias 11,0%).
Wnioski. Uzyskane wyniki wskazują na wysoką precyzję oznaczeń metabolitów witaminy D przy użyciu analizatora IDS-iSYS. Jednocześnie odnotowana zgodność tych metod z metodami rutynowo stosowanymi w Zakładzie Biochemii, Radioimmunologii i Medycyny Doświadczalnej sugeruje możliwość ich zastosowania w klinicznej praktyce szpitala pediatrycznego z zachowaniem najwyższych standardów diagnostyki laboratoryjnej.
Summary
Introduction. Vitamin D insufficiency coincides with increased risk of several diseases, including cancer, diabetes, autoimmune and cardiovascular disorders. Serum 25(OH)D is a reliable biomarker of vitamin D status that is used in everyday clinical practice. 1,25(OH)2D is hormonal active vitamin D metabolite stimulating intestinal absorption of both calcium and phosphorus. It also encourages bone resorption and mineralization.
Aim. Comparison of the methods for serum determination of 25(OH)D (automatic CLIA on IDS-iSYS and LIAISON analyzers) and 1,25(OH)2D (semi-automatic CLIA on IDS-iSYS analyzer and manual RIA) in pediatric and DEQAS samples.
Material and methods. The intra- and intervariability of 25(OH)D and 1,25(OH)2D measurements on the IDS-iSYS platform in pediatric samples were calculated. The accuracy of the CLIA method of 25(OH)D quantification on the IDS-iSYS was evaluated using DEQAS HPLC and LC-MS/MS data. The comparison of the CLIA method of 25(OH)D and 1,25(OH)2D determinations on IDS-iSYS platform with the CLIA method on LIAISON machine and manual RIA method, respectively, was performed.
Results. The CLIA methods of 25(OH)D and 1,25(OH)2D determinations on the IDS-iSYS platform were characterized by high repeatability (2.6 and 6.4%, respectively) and reproducibility (9.1 and 9.6%, respectively). The disagreement noted between methods in 25(OH)D results in pediatric and DEQAS samples (the bias 25.7 and 49.4%, respectively) may be due to differences in the cross-reactivity with the vitamin D metabolites. The comparison of methods of 1,25(OH)2D determination showed their good compatibility in pediatric samples (the bias of 11.0%).
Conclusions. The study indicate high precision of serum 25(OH)D and 1,25(OH)2D determinations using CLIA methods on the IDS-iSYS platform. The comparison of these methods with the methods routinely used in the Department of Biochemistry, Radioimmunology and Experimental Medicine made the possibility of their use in the clinical practice of pediatric hospital with maintenance of the highest diagnostic standards.
WPROWADZENIE
Właściwe zaopatrzenie organizmu w witaminę D odgrywa fundamentalną rolę nie tylko w regulacji gospodarki wapniowo-fosforanowej, ale także zapewnia prawidłowe funkcjonowanie niemal wszystkich tkanek i narządów. Wykazano, że niedobory i deficyty witaminy D są czynnikiem ryzyka wystąpienia i rozwoju chorób nowotworowych, autoimmunologicznych, sercowo-naczyniowych oraz cukrzycy (1, 2). Udokumentowano, że pozanerkowa synteza aktywnego metabolitu witaminy D, czyli 1,25-dihydroksywitaminy D [1,25(OH)2D] ma kluczowe znaczenie dla funkcji układu immunologicznego i wewnątrzwydzielniczego, a także dla równowagi między proliferacją, różnicowaniem się i apoptozą komórkową (3-8). 25-hydroksywitamina D (25(OH)D) ze względu na długi okres półtrwania (około 3 tygodni jest głównym parametrem oceny zaopatrzenia organizmu w witaminę D (9). Pomiar stężenia 25(OH)D w surowicy informuje o ilości substratu dostępnego dla nerkowej syntezy aktywnego hormonalnie 1,25(OH)2D.
1,25(OH)2D jest jednym z głównych czynników regulujących metabolizm wapnia i fosforu, oddziałującym przez stymulację wchłaniania wapnia w jelitach i zwiększenie resorpcji kości. Jednocześnie hamuje produkcję parathormonu zarówno przez bezpośrednie oddziaływanie na gruczoły przytarczycowe, jak i pośrednio, podnosząc poziom wapnia we krwi. Wytwarzanie 1,25(OH)2D jest stymulowane przez parathormon, co skutkuje powstaniem efektywnej pętli sprzężenia zwrotnego (10). Wytwarzany przez kości czynnik FGF23 hamuje natomiast syntezę 1,25(OH)2D (11).
Oznaczanie stężenia 25(OH)D oraz 1,25(OH)2D w surowicy jest procedurą trudną z kilku podstawowych przyczyn: (1) dużej hydrofobowości 25(OH)D oraz 1,25(OH)2D, co wiąże się z zagrożeniem interferencji licznych składników surowicy (tzw. efekt matrix); (2) występowania w surowicy pochodnych witaminy zarówno D2, jak i D3; (3) występowania w surowicy stereoizomeru 3-epi-25(OH)D3; (4) stężenia 1,25(OH)2D w surowicy na poziomie pg/ml (12, 13). Notowane ostatnio znaczące zwiększenie zapotrzebowania na ocenę zaopatrzenia w witaminę D u pacjentów z wielu grup ryzyka spowodowało konieczność opracowania nowych i łatwo dostępnych metod oznaczania stężenia 25(OH)D w surowicy. Zgodnie z aktualnymi zaleceniami (1, 2) automatyczne platformy IDS-iSYS i LIAISON wprowadziły procedury równoczesnego oznaczania 25(OH)D2 i 25(OH)D3 (25(OH)D total) w surowicy, które wykorzystujemy do badań w materiale pediatrycznym Instytutu „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka” (IPCZD). W systemie IDS-iSYS możliwe jest również oznaczanie 1,25(OH)2D metodą półautomatyczną. Oba badania podlegają międzynarodowej kontroli jakości oznaczeń metabolitów witaminy D w systemie certyfikującym DEQAS (The International External Quality Assessment Scheme for Vitamin D Metabolites) (14-16).
CEL PRACY
Celem pracy była analiza precyzji i dokładności oraz porównanie metod oznaczeń stężeń metabolitów witaminy D w surowicy krwi: automatycznej chemiluminescencyjnej (CLIA) metody pomiaru stężenia 25(OH)D na analizatorze IDS-iSYS względem metody automatycznej CLIA na analizatorze LIAISON oraz półautomatycznej metody CLIA pomiaru stężeń 1,25(OH)2D na analizatorze IDS-iSYS względem metody manualnej radioimmunologicznej (RIA) z wykorzystaniem materiału pediatrycznego IPCZD oraz próbek kontrolnych systemu DEQAS.
MATERIAŁ I METODY
Protokół badania
Do badań precyzji oznaczeń stężeń 25(OH)D total (25(OH)D2 + 25(OH)D3) oraz 1,25(OH)2D wykorzystano mieszaninę surowic (surowica zlewkowa) pozostałych po rutynowych oznaczeniach 25(OH)D oraz 1,25(OH)2D u pacjentów IPCZD. Do badań powtarzalności oraz odtwarzalności surowicę zlewkową dzielono na porcje odpowiadające jednemu badaniu. Badania powtarzalności wykonywano w trakcie jednego dnia prowadzenia oznaczeń, natomiast oznaczenia pozwalające ocenić odtwarzalność prowadzono w odrębnych cyklach uruchamiania analizatora. Do oceny zgodności wyników oznaczeń 25(OH)D total wykonanych automatyczną metodą CLIA na analizatorze IDS-iSYS względem automatycznej metody CLIA na analizatorze LIAISON wykorzystano 100 próbek surowicy pochodzącej od pacjentów IPCZD. Do oceny zgodności wyników oznaczeń 1,25(OH)2D wykonanych metodą półautomatyczną CLIA na analizatorze IDS-iSYS względem metody manualnej RIA wykorzystano 70 próbek surowicy pochodzącej od pacjentów IPCZD.
Do analizy dokładności automatycznej metody CLIA oznaczeń stężeń 25(OH)D total na analizatorze IDS-iSYS wykorzystano 40 próbek kontrolnych systemu kontroli jakości DEQAS (numery 411-450) i porównano z wynikami oznaczeń wykonanymi metodami wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz tandemowej spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową (LC-MS/MS) stanowiącymi „złoty standard” oznaczeń stężenia 25(OH)D. Te same próbki kontrolne posłużyły dodatkowo do oceny zgodności metod oznaczania stężenia 25(OH)D na analizatorze IDS-iSYS względem LIAISON. Wartości stężeń 25(OH)D mierzonych metodami HPLC i LC-MS/MS stanowią wartość średnią wyników oznaczeń wykonanych przez uczestników kontroli jakości DEQAS i pochodzą z informacji dostarczanych ośrodkom biorącym udział w tejże kontroli. Międzynarodowa kontrola jakości DEQAS prowadzona jest w Zakładzie Biochemii, Radioimmunologii i Medycyny Doświadczalnej (ZBRiMD) IPCZD od 2009 roku (certyfikat DEQAS) dla metod rutynowo stosowanych do pomiaru stężeń metabolitów witaminy D, to jest metody automatycznej CLIA oznaczeń stężeń 25(OH)D na analizatorze LIAISON oraz metody manualnej RIA oznaczeń stężeń 1,25(OH)2D.
Analizy przeprowadzone na posiadanym materiale zostały wykonane w ramach badań statutowych poszerzonej kontroli jakości w ZBRiMD IPCZD. Badania nie wymagały zgody Komisji Bioetycznej. Badacze nie mieli dostępu do danych osobowych pacjentów.
Test IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D
IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D (IDS-iSYS, Immunodiagnostic Systems) jest testem kompetycyjnym wykorzystującym zjawisko chemiluminescencji. We wstępnej fazie oznaczenia, przy użyciu odczynnika zawierającego NaOH, następuje uwolnienie zawartej w próbce 25(OH)D z białka wiążącego witaminę D (DBP). Kolejnym etapem jest inkubacja badanej próbki ze swoistymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko 25(OH)D wyznakowanymi akrydyną. Następnie do mieszaniny dodawane są cząstki magnetyczne związane z 25(OH)D, które wiążą się z kompleksem przeciwciało-25(OH)D powstałym w czasie pierwszej inkubacji w pozostałych wolnych miejscach. Po inkubacji mieszanina reakcyjna zostaje przeniesiona do komory pomiarowej, gdzie, na zasadzie oddziaływań magnetycznych pomiędzy elektrodą a cząstkami magnetycznymi, cały kompleks jest wychwytywany przez elektrodę. Następuje inicjacja reakcji z udziałem akrydyny, której produkt stanowią fotony światła zliczane przez fotopowielacz we względnych jednostkach luminescencji (ang. relative light unit – RLU). Ich ilość jest odwrotnie proporcjonalna do ilości 25(OH)D znajdującej się w próbce badanej. Stężenie 25(OH)D odczytywane jest z krzywej kalibracyjnej.
Test 1,25-Dihydroxy Vitamin D
Test IDS-iSYS 1,25-Dihydroxy Vitamin D (IDS-iSYS, Immunodiagnostic Systems) to kompletny półautomatyczny system umożliwiający oznaczenie stężenia 1,25(OH)2D w surowicy. Pierwszy etap oznaczenia wykonywany jest manualnie i polega na immunologicznym oczyszczeniu badanej próbki z użyciem kapsułki z żelem związanym z monoklonalnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko 1,25(OH)2D. Przed naniesieniem na żel, badaną próbkę poddaje się delipidacji siarczanem dekstranu i chlorkiem magnezu. Niezwiązane z żelem substancje usuwane są przy użyciu metanolu, natomiast wymywanie zabsorbowanego 1,25(OH)2D odbywa się przy pomocy etanolu. Eluaty poddaje się następnie odparowaniu w atmosferze azotu w temperaturze 40°C. Kolejne etapy oznaczenia wykonywane są automatycznie przez analizator IDS-iSYS, począwszy od inkubacji oczyszczonej próbki z biotynylowanym przeciwciałem owczym skierowanym przeciwko 1,25(OH)2D. W następnym etapie dodawana jest 1,25(OH)2D znakowana akrydyną, która współzawodniczy o miejsca wiązania przeciwciał. W końcowej fazie oznaczenia pokryte streptawidyną magnetyczne cząstki wiążą, na zasadzie oddziaływań z biotyną, powstały kompleks, który po odpłukaniu z niezwiązanego materiału wyłapywany jest przez elektrodę. Dodanie odczynników wyzwalających inicjalizuje reakcję chemiluminescencyjną. Mierzony przez fotopowielacz w jednostkach RLU sygnał świetlny jest odwrotnie proporcjonalny do ilości 1,25(OH)2D zawartego w próbkach badanych. Stężenie 1,25(OH)2D odczytywane jest z krzywej kalibracyjnej.
Test 25(OH) Vitamin D Total
Liaison 25(OH) Vitamin D Total (LIAISON, Biomedica Gruppe) jest kompetycyjnym testem wykorzystującym zjawisko chemiluminescencji, gdzie do identyfikacji 25(OH)D zastosowano specyficzne przeciwciało. W trakcie pierwszej inkubacji odczynnik zawierający etanol oraz detergent powoduje uwolnienie 25(OH)D zawartej w próbce badanej z DBP. Wolna 25(OH)D ulega wiązaniu z przeciwciałem opłaszczającym cząstki paramagnetyczne. W następnym etapie dodawana jest znakowana izoluminolem 25(OH)D, która współzawodniczy z 25(OH)D zawartą w próbce badanej o wiązanie z przeciwciałem. Po inkubacji materiał niezwiązany usuwany jest w trakcie płukania. W końcowej fazie oznaczenia dodawany jest odczynnik inicjujący reakcję, której produktem są fotony świetlne zliczane za pomocą fotopowielacza w jednostkach RLU. Ich ilość jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia 25(OH)D w próbce badanej odczytywanego z krzywej kalibracyjnej.
Test 1,25(OH)2-Vitamin D-RIA-CT
Test 1,25(OH)2-Vitamin D-RIA-CT (DIASource) jest manualnym testem RIA. Zasadą metody jest współzawodnictwo stałej ilości 1,25(OH)2D znakowanej radioaktywnym I125 ze zmienną ilością 1,25(OH)2D pochodzącą z próbki badanej o stałą ilość miejsc wiążących na specyficznych przeciwciałach opłaszczających wewnętrzną powierzchnię probówek. Próbki surowicy badanej są wstępnie ekstrahowane i wieloetapowo czyszczone przy użyciu rozpuszczalników organicznych (eter dwuizopropylowy, cykloheksan, octan etylu, etanol bezwodny, dwuchlorometan). Stężenia 1,25(OH)2D odczytywane są z krzywej kalibracyjnej wykonywanej równocześnie przy każdej serii oznaczeń.
Analiza statystyczna
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Pludowski P, Holick MF, Pilz S et al.: Vitamin D effects on musculoskeletal health, immunity, autoimmunity, cardiovascular disease, cancer, fertility, pregnancy, dementia and mortality – a review of recent evidence. Autoimmun Rev 2013; 12(10): 976-989.
2. Holick MF, Binkley NC, Bishoff-Ferrari HA et al.: Evaluation, treatment and prevention of vitamin D deficiency: an endocrine society clinical practice guideline. J Clin Endocrinol Metab 2011; 96: 1911-1930.
3. Giovannucci E: Epidemiological evidence for vitamin D colorectal cancer. J Bone Miner Res 2007; 22 (suppl. 2): V81-V85.
4. Giovannucci E, Liu Y, Hollis BW: 25-hydroxyvitamin D and risk of myocardial infarction in men: a prospective study. Arch Intern Med 2008; 168: 1174-1180.
5. Dobnig H, Pilz S, Scharnagal H et al.: Independent association of low serum 25-hydroxyvitamin D and 1,25-dihydroxyvitamin D levels with all-cause and cardiovascular mortality. Arch Intern Med 2008; 168: 1340-1349.
6. Forman JP, Giovannucci E, Holmes MD et al.: Plasma 25-hydroxyvitamin D levels and risk of incident hypertension. Hypertension 2007; 49: 1063-1069.
7. Pitz S, Henry RM, Sinijder MD et al.: 25-hydroxyvitamin D is not associated with carotid intima-media thickness in older men and women. Calcify Tissue Int 2009; 84: 423-424.
8. Harris SS: Vitamin D in Type 1 diabetes prevention. J Nutr 2005; 135: 323-325.
9. Hollis BW: Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr 2008; 88: 507S-510S.
10. Hollick MF: Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007; 357: 266-281.
11. Shimada T, Hasegawa H, Yamazaki Y et al.: FGF-23 is a potent regulator of vitamin D metabolism and phosphate homeostasis. J Bone Miner Res 2004; 19: 429-435.
12. Carter GD: 25-hydroxyvitamin D assays: the quest for accuracy. Clin Chem 2009; 55: 1300-1302.
13. Carter GD: Accuracy of 25-hydroxyvitamin D assays: confronting the issues. Curr Drug Targets 2011; 1291: 19-28.
14. Carter GD, Carter R, Jones J, Berry J: How accurate are assays for 25-hydroxyvitamin D? Data from the International Vitamin D External Quality. Clin Chem 2004; 50: 2195-2197.
15. Carter GD, Berry JL, Gunter E et al.: Proficiency testing of 25-hydroxyvitamin D (25-OHD) assays. J Steroid Biochem Mol Biol 2010; 121: 176-179.
16. Carter GD, Jones JC: Use of a common standard improves the performance of liquid chromatography-tandem mass spectrometry methods for serum 25-hydroxyvitamin-D. Ann Clin Biochem 2009; 46: 79-81.
17. Bland JM, Altman DG: Statistical method for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet 1986; 1: 307-310.
18. Bland JM, Altman DG: Comparing methods of measurement: why plotting difference against standard methods is misleading. Lancet 1995; 346: 1085-1087.
19. Westgard JO, Hunt MR: Use and interpretation of common statistical tests in method-comparison studies. Clin Chem 1973; 19: 49-57.
20. Dallal GA: Comparing two measurement devices. The Little Handbook of Statistical Practice; http://www.tufts.edu/~gdallal/LHSP.HTM.
21. Lips P, Chapuy MC, Dawson-Hughes B et al.: An international comparison of serum 25-hydroxyvitamin D measurements. Osteoporosis Int 1999; 9: 394-397.
22. Wagner D, Heather EC, Hanwell EC, Vieth R: An evaluation of automated methods for measurement of serum 25-hydroxyvitamin D. Clin Bioch 2009; 42: 1549-1556.
23. Wallace AM, Gibson S, de la Hunty A et al.: Measurement of 25-hydrozyvitamin D in the clinical laboratory: current procedures, performance characteristics and limitations. Steroids 2010; 75: 477-488.
24. Moon HW, Cho JH, Hur M et al.: Comparison of four current 25-hydroxyvitamin D assays. Clin Biochem 2012; 45: 326-330.
25. Binkley N, Krueger DC, Morgan S, Wiebe D: Current status of clinical 25-hydroxyvitamin D measurement: an assessment of between-laboratory agreement. Clin Chim Acta 2010; 411: 1976-1982.
