Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Nowa Medycyna 7/1999, s. 20-22
Agnieszka Zembroń-Łacny, Kazimierz Szyszka, Barbara Sobańska, Rafał Pakuła
Przemiana glutationu we krwi biegaczy średniodystansowych
z Instytutu Wychowania Fizycznego w Gorzowie Wlkp.
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Maria Kwilecka
Streszczenie
The major factors determining the intensity of oxidative stress, which is induced by physical effort are intensity and duration of exercise and the type of performed exercise. The aim of research was define the changes in prooxidant-antioxidant equilibrium, which occurred under the influence of exercise of maximum intensity. The research included a group of 12 sportsmen AZS AWF in Gorzów Wlkp. Training middle distance race. They performed 3 min running exercise of an increasing intensity to exhaustion, which were separated by 1 min rest period. The test was performed on a treadmill, inclined at 2°. The speed of the first exercise stages was 10.3 km/h, and to the ones that followed 2 km/h were added. The physical test evoked in blood a 34% (p < 0.005) increase of the total glutathione (GSH + GSSG) with no change in concentration of the reduced form (GSH). The activity of glutathione reductase (GR) in red blood cells increased during the effort by 28% (p < 0.05). This indicates the intensification of glutathione metabolism mainly in red blood cells. In the plasma 2.6 times increase of GSH + GSSG concentration accompanied by a simultaneous 12% (p < 0.05) decrease of GR activity was noticed after exercise (30 min rest). This may indicate release of GSH from liver. No changes in the level of lipid peroxidation products in red blood cells were noticed during the exercise. The intensification of glutathione metabolism with no change in process of lipid peroxidation in the blood of the tested sportsmen indicates efficient defense against oxidative stress.
Wstęp
Pojęcie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej wiąże się z powstawaniem reaktywnych form tlenu (RFT) zarówno pod wpływem czynników środowiskowych jak i w trakcie przemian metabolicznych w naszym organizmie. Według Li Li Ji 2-5% pochłoniętego tlenu ulega przemianie do RFT obejmujących: anionorodnik ponadtlenkowy (O2.) – produkt jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego, rodnik wodoronadtlenkowy (HO2.) – produkt reakcji protonacji O2., nadtlenek wodoru (H2O2) – produkt reakcji dysmutacji O2., rodnik wodorotlenowy (.OH) powstający z pozostałych RFT w obecności jonów metali grup przejściowych (żelazo, miedź) oraz tlen singletowy (1O2) (8). Wzrost wytwarzania RFT przy nieskutecznej obronie antyoksydacyjnej prowadzi do powstania stresu oksydacyjnego, czyli zaburzenia równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej w kierunku reakcji utleniania (12). Organizm broniąc się przed stresem oksydacyjnym stworzył system antyoksydantów nazywany obroną lub barierą antyoksydacyjną, obejmujący związki drobnocząsteczkowe egzo- (wit. E, wit. C, β-karoten) i endogenne (glutation, bilirubina, kwas moczowy) oraz enzymy (dysmutaza ponadtlenkowa SOD, katalaza CAT, peroksydaza glutationowa GPx, reduktaza glutationowa GR) (6). W grupie drobnocząsteczkowych hydrofilowych antyoksydantów na szczególną uwagę zasługuje glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna, GSH) ze względu na swoją wielofunkcyjność. Glutation unieszkodliwia wszystkie formy RFT, chroni grupy tiolowe białek przed nieodwracalną inaktywacją wywołaną przez RFT, usuwa skutki szkodliwej działalności RFT, a mianowicie uczestniczy w rozkładzie nadtlenków lipidowych – produktów uszkodzenia lipidów. Ponadto glutation pełni wiele funkcji w naszym organizmie nie związanych z obroną antyoksydacyjną. Bierze udział w detoksykacji związków elektrofilowych, w metabolizmie leukotrienów i prostaglandyn, redukuje kwas dehydroaskorbinowy do kwasu askorbinowego, uczestniczy w redukcji methemoglobiny, jest formą transportu cysteiny, wpływa na aktywność enzymów glikolizy. Głównym miejscem syntezy glutationu jest wątroba, skąd drogą krwi wędruje do innych tkanek. Komórki zdolne do pobierania GSH posiadają na swojej powierzchni γ-glutamylotranspeptydazę. Pomiary aktywności tego enzymu wskazują, że głównymi konsumentami GSH są: nerki, mózg, limfocyty płuca i intensywnie pracujące mięśnie (4, 5, 6, 8).
Udział glutationu w reakcjach z RFT lub z produktami utlenienia związków organicznych przez RFT (proces peroksydacji) powoduje jego przejście do formy disulfidowej (GSSG). Enzymem odpowiedzialnym za redukcję glutationu jest reduktaza glutationowa (GR), która utrzymuje stosunek GSH do GSSG na poziomie 200:1 tzn. 99,5% glutationu występuje w formie zredukowanej. Proces redukcji jest zasocjowany z cyklem pentozowym lub cyklem Krebsa, które są źródłem NADPH będącego donorem protonów (5).
Z naszych dotychczasowych badań wynika, że zmiana poziomu glutationu formy zredukowanej lub utlenionej w trakcie wysiłku fizycznego zależy od intensywności i charakteru wykonanej pracy (14, 15).
Celem obecnych badań było określenie wpływu wysiłku fizycznego o charakterze szybkościowym na natężenie przemiany glutationu i poziom produktów peroksydacji lipidów we krwi biegaczy średniodystansowych.
Materiały i metody
Badania przeprowadzono na 12-osobowej grupie zawodników II-ligowego zespołu lekkoatletycznego AZS-AWF w Gorzowie Wlkp. uprawiających biegi średnie (800 i 1500 m). Charakterystykę badanych zawodników przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Charakterystyka badanych biegaczy średniodystansowch (x ? SD).
Wiek (lata)Masa ciała (kg)Wzrost (cm)Staż treningowy (lata)
21,25 ? 1,1468,75 ? 4,65179,17 ? 4,475,67 ? 1,78
Zawodnicy wykonali 3-minutowe wysiłki biegowe o narastającej intensywności do odmowy, przerywane 1 min okresami odpoczynku. Test przeprowadzono na bieżni mechanicznej Trackmaster TM-310 o kącie nachylenia 2°. Prędkość pierwszego wysiłku wynosiła 10,3 km/h, następne zwiększano o 2 km/h. W czasie testu pobierano krew trzykrotnie z żyły łokciowej: przed próbą wysiłkową, w pierwszej minucie po jej zakończeniu i po 30 min odpoczynku.
W pełnej krwi oznaczono poziom zredukowanego glutationu (GSH) metodą Beutlera i wsp. (1), całkowitego glutationu (GSH + GSSG) metodą Tietze (13) i kwasu mlekowego (LA) przy pomocy zestawu dr Lange.
W krwinkach czerwonych oznaczono poziom produktów peroksydacji lipidów z zastosowaniem kwasu tiobarbiturowego (TBARS) metodą Buege i Aust´a (3). Stężenie hemoglobiny w masie krwinkowej i hemolizatach określono metodą Drabkina.
W osoczu krwi oznaczono poziom całkowitego glutationu (GSH + GSSG) metodą Tietze (24), aktywność reduktazy glutationowej (GR, EC1.6.4.2) przy pomocy zestawu firmy Randox i poziom białka metodą Bradforda (2).
Wyniki badań
Uzyskane wyniki badań w przeprowadzonym teście wysiłkowym przedstawiono w tabeli 2. We krwi badanych zawodników stwierdzono nasilenie przemiany glutationu, o czym świadczy dwukrotny wzrost poziomu GSH + GSSG i 15% spadek aktywności GR w osoczu krwi po 30 min odpoczynku oraz wysiłkowy 34% wzrost poziomu GSH + GSSG w pełnej krwi i 28% wzrost aktywności GR w krwinkach przy statystycznie nieistotnym 4% wzroście formy zredukowanej (GSH) w pełnej krwi. W krwinkach czerwonych nie zanotowano nasilenia procesu peroksydacji (utleniania) lipidów błonowych, o czym świadczy brak zmian stężenia TBARS. Poziom LA wzrósł ponad 8-krotnie, co wskazuje na wysiłek o maksymalnej intensywności i przewadze procesów beztlenowych w resyntezie ATP.
Tabela 2. Zmiana poziomu parametrów równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej oraz kwasu mlekowego (LA) we krwi biegaczy średniodystansowych (x ? SD).
 SpoczynekWysiłekRestytucja
GSH + GSSG w osoczu mg/ml1,13 ? 0,410,88 ? 0,252,3 ? 0,84**
GR w osoczu U/g białka28 ? 6,3327,3 ? 3,5623,9 ? 4,35**
GSH + GSSG we krwi mg/ml429 ? 93577 ? 87*456 ? 127
GSH we krwi mg/ml304 ? 42317 ? 36303 ? 35
GR w erytrocytach U/gHb8,82 ? 2,6311,27 ? 1,83*12,17 ? 2,11**
TBARS w erytrocytach mmol/gHb1,77 ? 0,411,76 ? 0,51,71 ? 0,5
LA mmol/l1,56 ? 0,3312,93 ? 1,81*4,19 ? 1,55**
*różnice statystycznie istotne (p < 0,05) zaznaczono w odpowiedniej kolumnie w stosunku do wartości spoczynkowej.

Między poziomem LA a GSH + GSSG w pełnej krwi stwierdzono dodatnią korelację r = 0,578 (p < 0,001).
Dyskusja
Intensywny wysiłek fizyczny zwiększa wymagania pracujących mięśni na antyoksydanty drobnocząsteczkowe, do których należy glutation. Potwierdzają to badania przeprowadzone przez Marin i wsp. (9), którzy badając wpływ 30-tygodniowego treningu na aktywność enzymów syntezy glutationu w mięśniach szkieletowych psów i poziom glutationu w osoczu, zaobserwowali 2 i 3-krotny wzrost aktywności syntezy glutamycysteinowej i syntetazy glutationowej w mięśniach szkieletowych oraz wzrost stężenia całkowitego glutationu w osoczu przy braku zmian stężenia formy utlenionej (GSSG). Autorzy wykazali także, że zmiany w cyklu glutationowym wywołane 30-tygodniowym treningiem skutecznie chroniły mięśnie szkieletowe psów przed stresem oksydacyjnym wywołanym jednorazowym intensywnym wysiłkiem fizycznym. Sen i wsp. (10) stwierdzili wyraźny wzrost aktywności γ-glutamyloranspeptydazy, enzymu odpowiedzialnego za wychwytywanie GSH przez komórki, we wszystkich mięśniach kończyn intensywnie trenowanych psów. Przeprowadzony w obecnych badaniach test wysiłkowy o maksymalnej intensywności wywołał po 30 min odpoczynku dwukrotny wzrost stężenia GSH + GSSG w osoczu biegaczy średniodystansowych. Wzrostowi poziomu glutationu towarzyszył 15% spadek aktywności reduktazy glutationowej w osoczu. Wiadomo, że aktywność GR rośnie przy wysokim stężeniu GSSG, który jest substratem reakcji katalizowanej przez ten enzym, natomiast jest hamowany przy fizjologicznych i wyższych stężeniach formy zredukowanej glutationu (GSH) (11), a więc wzrost całkowitego glutationu i obniżenie aktywności reduktazy glutationowej w osoczu badanych zawodników mógł nastąpić na skutek uwolnienia GSH z wątroby (główny organ syntezy glutationu) do osocza w odpowiedzi na zwiększone zapotrzebowanie pracujących mięśni. W warunkach fizjologicznych 90% glutationu obecnego w osoczu pochodzi z wątroby (5). Do podobnych wniosków doszli Lew i wsp. (7), którzy zaobserwowali spadek całkowitego glutationu w mięśniach i wątrobie a wzrost w osoczu krwi szczurów biegających do wyczerpania.
Zmiany glutationu całkowitego i zredukowanego w pełnej krwi dotyczą głównie krwinek czerwonych, gdyż zawierają one ponad 98% glutationu obecnego we krwi (4). O poziomie glutationu w erytrocytach decyduje nie tylko natężenie przemian oksydacyjnych wewnątrz krwinek, ale również udział glutationu w ochronie lipidów i białek szkieletu błonowego krwinki przed RFT oraz udział krwinek w międzytkankowej dystrybucji glutationu (4). Między poziomem kwasu mlekowego, który jest wskaźnikiem intensywności wykonanej pracy a stężeniem całkowitego glutationu w pełnej krwi stwierdzono dodatnią korelację (r = 0,578, p < 0,001), która wiąże się z zaangażowaniem erytrocytów w transporcie glutationu do tkanek narażonych na stres oksydacyjny, w tym przypadku mięśni szkieletowych. Wysiłkowy 34% wzrost GSH + GSSG i statystycznie nieistotny 4% wzrost stężenia GSH w pełnej krwi oraz 28% wzrost aktywności GR w krwinkach czerwonych badanych zawodników, wskazują na wzrost disulfidu glutationu (GSSG) z powodu jego udziału w ograniczaniu nadmiernej ilości RFT.
Krwinki czerwone z powodu dużej zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych (głównie kwasu arachidonowego) w wewnętrznej monowarstwie błony są predysponowane do uszkodzeń ze strony RFT (6). W wykonanych badaniach wzrost przemiany glutationu w krwinkach czerwonych zapobiegł nasileniu procesu peroksydacji lipidów erytrocytarnych, czego dowodem jest brak zmian stężenia TBARS. Nie należy jednak wykluczyć zmian w strukturze błon, które mogą nastąpić po dłuższym okresie odpoczynku.
Wniosek
Przeprowadzony test wysiłkowy u biegaczy średniodystansowych typowy do uprawianej przez nich dyscypliny sportowej wywołał korzystne przesunięcie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej we krwi, spowodowane wzrostem obrony antyoksydacyjnej przy braku zaburzenia struktury lipidowej błony.
Piśmiennictwo
1. Beutler E. et al.: Improvemed method for determination of blood glutathione. J. Lab. Clin. 1963, 61:882-888. 2. Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein – dye binding. Anal. Biochem., 1972, 72:248-254. 3. Buege J., Aust S.D.: The thiobarbituric acid assay. In: Techniques in Free Radical Research. Rice-Evans C.A., Diplock A.T., Symons M.C.R. (eds.) Elsevier Amsterda, London New York Tokyo 1991, 146-148. 4. Dass P.D. et al.: Renal and hepatic output of glutatione in plasma and whole blood. Biochem Biophys. Acta 1992, 1156:99-102. 5. De Leve L.D., Kaplovitz N.: Glutatione metabolism and its role in hepatotoxicity. Pharmac. Ther. 1991, 52:287-305. 6. Halliwell B., Gutteridge J.M.C.: Free Radicals In Biology and Medicine. 2nd Edition Clarendon Press Oxford, 1989. 7. Lew H. et al.: Changes in the glutatione status of plasma, liver and muscle following exhaustive exercise in rats. FEBS Letters 1985, 185(2):262-266. 8. Ji L.L.: Exercise and antioxidant systems. In: Congress Proceedings – 3th IOC World Congress on Sport Sciences Atlanta, Georgia 16-22.09.1995, 108-115. 9. Marin E. et al.: Enzymes of glutathione synthesis in dog skeletal muscles and their response to training. Acta Physiol. Scand., 1993, 147:369-373. 10. Sen C.K. et al.: Skeletal muscle and liver glutathione homeostasis in response to training, exercise, and immobilization. J. Appl. Physiol., 1992, 73:1265-1272. 11. Sexton D.J., Mutus B.: Glutathione reductase from a variety of sources inhibited by physiological levels of glutatione. Comp. Biochem. Physiol., 1992, 103B:897-901. 12. Siese H.: Oxidative stress: introductory remarks, In: Siese H. (ed.) Oxidative stress. Academic Press, New York 1985, 1-8. 13. Tietze F.: Enzymatic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Anal. Biochem., 1969, 27:502-522. 14. Zembroń-Łacny A. i wsp.: Równowaga prooksydacyjno-antyoksydacyjna u mężczyzn w wieku 30-60 lat uprawiających biegi długodystansowe. [W:] Aktywność ruchowa ludzi w różnym wieku. Uniwersytet Szczeciński IKF – Szczecin 4-5.12.1997. Materiały Naukowe. Uniwersytet Szczeciński Instytut Kultury Fizycznej. 230-236. 15. Zembroń-Łacny A. i wsp.: Wpływ treningu na poziom glutationu we krwi sportowców. IV Międzynarodowa Konferencja Nauka a Jakość Życia. Wilno 1996 (w druku).
Nowa Medycyna 7/1999
Strona internetowa czasopisma Nowa Medycyna

Pozostałe artykuły z numeru 7/1999: