Czytelnia Medyczna » Nowa Stomatologia » 3/2004 » Ocena korelacji pomiędzy poziomem IL-1b oraz metaloproteinazy – 8, 9 i TIMP-1 w krwi obwodowej pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia

- reklama -

Fitomed
kosmetyki ziołowe

Profesjonalny, stricte ręczny serwis narciarski Warszawa

- reklama -

Małgorzata Nędzi-Góra, Jan Kowalski, Renata Górska

Ocena korelacji pomiędzy poziomem IL-1b oraz metaloproteinazy – 8, 9 i TIMP-1 w krwi obwodowej pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia

Evaluation of correlations between il-B and mmp-8,9 and timp-1 levels in peridental blood of patients with chronic periodontis

z Zakładu Chorób Błony Śluzowej i Przyzębia IS AM w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. R. Górska

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Protetyka stomatologiczna

Stomatologia wieku rozwojowego

Periodontologiczno implantologiczna chirurgia plastyczna

Podstawową rolę w etiopatogenezie przewlekłego zapalenia przyzębia odgrywają Gram-ujemne bakterie beztlenowe. Mogą one w sposób bezpośredni niszczyć tkanki przyzębia poprzez działanie produktów przemiany materii, enzymów oraz endo- i egzotoksyn. Ponadto bakterie inicjują pośrednie mechanizmy degradacji tkanek przyzębia. Kolonizacja powierzchni zęba i pogłębiającej się kieszonki rosnącą liczbą bakterii Gram-ujemnych powoduje wzrost poziomu lipopolisacharydów bakteryjnych. LPS stymulują komórki stacjonarne w przyzębiu (keratynocyty, fibroblasty, komórki endotelialne) oraz komórki nacieku zapalnego (neutrofile, makrofagi, leukocyty PMN, limfocyty) do syntezy i wydzielania enzymów, szerokiego spektrum cytokin pro- i przeciwzapalnych (IL-1b, TNF-a) oraz lipidowych mediatorów stanu zapalnego (prostaglandyn, prostacyklin, leukotrienów i lipoksyn). Kluczową rolę w etiopatogenezie choroby przyzębia odgrywają cytokiny prozapalne, a wśród nich interleukina 1-b. Wykazano, że stymuluje ona chemotaksję neutrofilów i monocytów (a więc komórek pierwszej linii obrony), zwiększa syntezę białek ostrej fazy, aktywuje limfocyty T i pobudza limfocyty B (komórki odpowiedzi swoistej) do produkcji przeciwciał. IL-1b stymuluje również syntezę fosfolipazy A₂ i produkcję prostaglandyny E₂, która wraz z interleukiną 6 pobudza osteoklasty do niszczenia kości wyrostka zębodołowego. Ponadto IL-1b oraz inne cytokiny prozapalne (np. TNF-a), a także bezpośrednio lipopolisacharydy bakteryjne stymulują komórki nacieku zapalnego oraz komórki przyzębia do syntezy i wydzielania enzymów niszczących macierz kolagenową, tzw. metaloproteinaz macierzy (MMPs, matrix metalloproteinases) oraz zmniejszają wydzielanie ich tkankowych inhibitorów (TIMPs, tissue inhibitors of metalloproteinases) (1).

Chociaż mechanizm wzajemnego oddziaływania cytokin i enzymów nie jest do końca poznany wydaje się, że odgrywają one zasadniczą rolę w patomechanizmie choroby przyzębia. Poznanie wzajemnych oddziaływań IL-1b oraz metaloproteinaz może być również użyteczne ze względu na zastosowanie nowych metod leczenia zapalenia przyzębia z uwzględnieniem preparatów o charakterze inhibitorów metaloproteinaz oraz inhibitorów receptorów dla IL-1.

CEL PRACY

Celem pracy była ocena poziomu wybranych czynników prozapalnych (IL-1b, MMP-8, MMP-9) i przeciwzapalnych (TIMP-1) w krwi obwodowej osób zdrowych i pacjentów z chorobą przyzębia oraz ocena korelacji pomiędzy poziomami ww. mediatorów. Ponadto podjęto próbę oceny różnych technik pomiaru stężenia IL-1b w krwi obwodowej.

MATERIAŁ I METODY

Badanie przeprowadzono u 70 osób w wieku 20-65 lat (35 kobiet i 35 mężczyzn, średnia wieku 43,4), u których na podstawie wywiadu, badania klinicznego oraz analizy zdjęć radiologicznych rozpoznano przewlekłe zapalenie przyzębia, umiarkowane lub ciężkie.

Badanie kliniczne obejmowało pomiar następujących parametrów klinicznych:

– głębokość kieszonki (PD) (mm),

– kliniczna utrata przyczepu łącznotkankowego (CAL) (mm),

– wskaźnik płytki wg O´Leary´ego (PI) (%),

– wskaźnik krwawienia wg O´Leary´ego (BI) (%).

Badanie przeprowadzono z użyciem Florida Probe – sondy o stałej sile nacisku sprzężonej z komputerem, oraz standardowej kalibrowanej sondy periodontologicznej WHO.

W trakcie doboru grupy badanej w szczególności uwzględniano następujące kryteria:

1. Brak w wywiadzie schorzeń ogólnych.

2. W badaniu klinicznym co najmniej 30% kieszonek badanych ze stwierdzoną utratą przyczepu łącznotkankowego.

3. W każdym kwadrancie co najmniej 2 zęby.

4. W badaniu klinicznym co najmniej jedno miejsce pomiarowe z CAL> 5 mm.

Utworzono również dla celów porównawczych grupę kontrolną, do której zakwalifikowano 30 osób w wieku 20-35 lat (16 kobiet i 14 mężczyzn, średnia wieku 29,4), u których na podstawie wywiadu nie stwierdzono współistniejącego schorzenia ogólnoustrojowego. U osób tych nie stwierdzano zmian zapalnych w obrębie tkanek przyzębia, a CAL nie przekraczał 1 mm.

W celu analizy stężeń wybranych związków pobierano 8-10 ml krwi z żyły łokciowej do probówki bez dodatku antykoagulantów. Po wykrzepieniu odwirowywano osocze w centryfudze przy przeciążeniu 150 G (2400 obr/10 minut). Odwirowane osocze schładzano do tepmeratury 2-4 stopnie Celsjusza i przesyłano do laboratorium, gdzie było zamrażane od momentu wykonania badań. Pomiaru stężenia IL-1b, MMP-8, MMP-9 i TIMP-1 dokonywano za pomocą techniki immunoenzymatycznej (ELISA) z użyciem znakowanych przeciwciał monoklonalnych firmy R&D Systems (Quantikine). Ponadto u 20 pacjentów pomiar IL-1b wykonano z użyciem testu OptEIA (Pharmingen), umożliwiającego laborantowi samodzielne przygotowanie stężeń testowych. Do badań kwalifikowano tylko osocze klarowne, bez śladu hemolizy. Zgodnie z zaleceniami producenta testu każdą próbkę oznaczano dwukrotnie.

Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej z użyciem testu t-Studenta dla zmiennych niepowiązanych, przy założeniu znamienności statystycznej dla p<0,05. Wzajemną relację wariancji dla serii zmiennych wyliczano z użyciem testu Levene´a. Analizę korelacyjną wybranych zmiennych przeprowadzono z użyciem testu Pearsona przy założeniu znamienności dla p<0,05.

WYNIKI

Na wykresie 1 przedstawiono średnie stężenia IL-1b, MMP-8, MMP-9, TIMP-1 w krwi obwodowej osób z grupy badanej i grupy kontrolnej. Stwierdzono znamiennie wyższe stężenie IL-1b w krwi obwodowej osób chorych (4,16 pg/ml vs 1,12 pg/ml), któremu jednocześnie towarzyszyło znamiennie niższe stężenie MMP-8 (4 pg/ml vs 6,25 pg/ml). Średnie stężenia MMP-9 i TIMP-1 w krwi obwodowej były nieznacznie wyższe u osób z grupy badanej.

Wykres 1. Średnie stężenie wybranych IL-1b, MMP-8, MMP-9, TIMP-1 w krwi obwodowej.
LEGENDA:
p<0,05 – różnica znamienna statystycznie,

x (0,1) – średnie stężenia pomnożone przez wartość 0,1.

Tabela 1 przedstawia analizę korelacyjną stężeń IL-1b, MMP-8, MMP-9 i TIMP-1 w krwi obwodowej osób z grupy badanej. Wykazano bardzo silny związek wprost proporcjonalny pomiędzy stężeniem IL-1b i stężeniem MMP-9 (współczynnik Pearsona wynosi 0,76). Stwierdzono również słabą korelację pomiędzy IL-1b a TIMP-1 (0,38) oraz między MMP-9 a TIMP-1 (0,32).

Tabela 1. Korelacja stężeń IL-1b, MMP-8, MMP-9, TIMP-1 w krwi obwodowej.

	IL-1b	MMP-8	MMP-9	TIMP-1
IL-1b	X	0,18	0,76	0,38
MMP-8	0,18	X	0,18	-0,14
MMP-9	0,76	0,18	X	0,32
TIMP-1	0,38	-0,14	0,32	X

LEGENDA:
PD – głębokość kieszonki
CAL – kliniczna utrata przyczepu łącznotkankowego
BI – wskaźnik krwawienia
PI – wskaźnik płytki
XXX – korelacja znamienna statystycznie (p<0,05)

W tabeli 2 przedstawiono wyniki badania korelacji pomiędzy wybranymi parametrami klinicznymi stanu przyzębia a IL-1b, MMP-8, MMP-9, TIMP-1. Nie stwierdzono korelacji dla żadnej z badanych par zmiennych.

Tabela 2. Korelacja pomiędzy IL-1b, MMP-8, MMP-9, TIMP-1 parametrami klinicznymi stanu przyzębia.

	IL-1b	MMP-8	MMP-9	TIMP-1
PD	0,16	0,09	0,10	-0,14
CAL	0,11	0,19	0,06	0,06
BI	0,23	0,30	0,04	-0,09
PI	0,21	0,03	0,13	0,10
Liczba zębów	-0,07	-0,33	0,01	0,25

LEGENDA:
PD – głębokość kieszonki
CAL – kliniczna utrata przyczepu łącznotkankowego
BI – wskaźnik krwawienia
PI – wskaźnik płytki

Na wykresie 2 przedstawiono porównanie stężeń IL-1b mierzonych za pomocą zestawów przygotowanych przez dwóch producentów. Nie stwierdzono różnic znamiennych statystycznie pomiędzy wynikami w obu podgrupach pacjentów.

Wykres 2. Porównanie średnich stężeń IL-1b mierzonych przy użyciu zestawów Quantikine i OptEIA, p>0,05.

DYSKUSJA

Patogeny i cytokiny prozapalne pełnią ważną rolę w destrukcji tkanek i niszczeniu macierzy zewnątrzkomórkowej w chorobach przyzębia. Dlatego aktywacja MMP może być jedną z dyskretnych ścieżek aktywności degradacyjnej organizmu w patogenezie zapalenia przyzębia (2).

Większość genów metaloproteinaz nie ulega stałej ekspresji w warunkach fizjologicznych. Czynnikami inicjującymi transkrypcję genów są cytokiny prozapalne, takie jak IL-1b i TNF-a oraz czynniki wzrostu, takie jak PDGF, EGF (3, 4, 5, 6, 7). Z kolei cytokiny przeciwzapalne, takie jak TGF-b są raczej odpowiedzialne za hamowanie transkrypcji genów dla metaloproteinaz (8, 9, 10). Należy jednak zwrócić uwagę, że różne typy komórek nie reagują w ten sam sposób na daną cytokinę, oraz że cytokiny mogą działać wobec siebie synergistycznie lub antagonistycznie. Ponadto wykazano, że istnieje tzw. krzyżowa regulacja pomiędzy MMPs i IL-1b. Niektóre metaloproteinazy (np. MMP-1, 2, 3, 9) wydzielone przez pobudzone komórki tkanki łącznej mogą zwrotnie regulować poziom IL-1b poprzez jej degradację do biologicznie nieaktywnych fragmentów (11). I odwrotnie, w niektórych warunkach MMPs mogą przekształcać nieaktywny prekursor L-1b do formy aktywnej. Shonbeck i wsp.(12) wykazali, że MMP-3,2 i 9 przekształcają rekombinowany ludzki prekursor IL-1b w formę aktywną, ale przedłużona inkubacja z MMP-3 powoduje degradację aktywnej IL-1b in vitro. Rozkład przez metaloproteinazy jest alternatywą dla działania kaspazy – enzymu rozkładającego IL-1b. Tak więc MMPs, których produkcja jest wywoływana przez IL-1b mogą zwrotnie hamować aktywność tej cytokiny. Należy więc zwrócić uwagę na fakt, że hamowanie metaloproteinaz przez inhibitory syntetyczne może paradoksalnie spowodować nadmierną aktywację IL-1b. MMPs mają również zdolność regulacji aktywności receptorów komórkowych dla cytokin.

W badaniu własnym stwierdzono silną korelację pomiędzy stężeniem IL-1b a stężeniem MMP-9. Znajduje to potwierdzenie w badaniach innych autorów, donoszących o bezpośrednim związku między tymi dwoma mediatorami. W chwili obecnej raczej nie kwestionuje się jego istoty. Badania są raczej ukierunkowane na określenie charakteru tego związku. Wydaje się, że IL-1b poprzez swój receptor stymuluje neutrofile do syntezy i wydzielania MMP-9 za pośrednictwem dwóch mediatorów wewnątrzkomórkowych: NfkappaB i AP-1. Umożliwia to niezakłóconą syntezę MMP-9 w odpowiedzi na czynnik bakteryjny (antygen) stymulujący makrofagi do sekrecji IL-1b (13). Zahamowanie pobudzenia receptora dla IL-1 powoduje zatrzymanie produkcji MMP-9. Chang i wsp. (14) badali regulowanie stężeń MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2 przez IL-1b w przypadkach owrzodzeń i infekcji rogówki. Stwierdzili, że podanie przeciwciała neutralizującego IL-1b skutkowało znacznym zmniejszeniem ilości MMP-9 oraz zmianą czasu ekspresji TIMP-1 i TIMP-2, przy czym zmniejszenie ilości MMP-9 przez antyIL-1b w trakcie procesu zapalnego było znacznie większe niż analogiczne w tkance zdrowej (13).

W ciągu ostatnich lat bezsprzecznie udowodniono kluczową rolę, jaką IL-1b pełni w patomechanizmie procesu zapalnego toczącego się w przyzębiu. Interleukina 1 jest wydzielana głównie przez monocyty i pośredniczy w wydzielaniu całego spektrum związków odpowiedzialnych za destrukcję tkanki łącznej i kości wyrostka zębodołowego. Interleukina 1 in situ w chorobie przyzębia osiąga miana stężeń kilkudziesięciokrotnie przekraczające wartości stwierdzane u osób zdrowych. Stwierdzone w niniejszym badaniu podwyższenie średniego stężenia IL-1b w krwi obwodowej może wynikać z gradientu stężeń między tkankami przyzębia a łożyskiem naczyniowym, bądź z obecności w krwiobiegu migrujących makrofagów, które wydzielają IL-1b. Stwierdzony obniżony poziom MMP-8 w krwi pacjentów z zapaleniem przyzębia w stosunku do osób z grupy kontrolnej pozwala przypuszczać, że pula komórek zapalnych produkujących ten enzym (m.in. neutrofilów) przemieszcza się do miejsca zapalenia.

Przeprowadzone badanie nie wykazało znamiennych statystycznie różnic w stężeniach IL-1b mierzonych przy użyciu zestawów dwóch producentów. Zestaw OptEIA umożliwia samodzielne przygotowanie stężeń testowych. Pozwala to na efektywniejsze wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych w przypadku związków badanych, których spodziewane stężenie w medium pobieranym jest stosunkowo niewielkie. Wydaje się więc, że przy pomiarze IL-1b i MMP-8 można wykorzystać odczynnik na przebadanie większej ilości pacjentów niż w przypadku Quantikine. Do MMP-9 i TIMP-1 nie znajduje to zastosowania, gdyż spotyka się wysokie stężenia tych związków w krwi obwodowej. Na korzyść odczyników Quantikine przemawia z kolei mniejsza możliwość popełnienia błędu na etapie badań laboratoryjnych (np. nierzetelnie przygotowane stężenia testowe zestawów OptEIA).

WNIOSKI

? Badania wykazały znamiennie wyższe stężenie IL-1b i znamiennie niższe stężenie MMP-8 w krwi obwodowej osób z chorobą przyzębia w porównaniu do osób zdrowych.

? Stwierdzono silną korelację pomiędzy stężeniami IL-1b i MMP-9 w krwi obwodowej. Słabą korelację stwierdzono pomiędzy IL-1b i TIMP-1 oraz MMP-9 i TIMP-1.

? Nie stwierdzono korelacji pomiędzy pomiarami klinicznymi a stężeniami mediatorów w krwi obwodowej.

? Oba rodzaje testów immunoenzymatycznych (OptEIA i Quantikine) wydają się wykazywać podobną czułość, co pozwalałoby na ich zamienne stosowanie.

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Otorynolaryngologia dla studentów medycyny i stomatologii

Radiologia Stomatologiczna

Biochemia jamy ustnej

Piśmiennictwo

1. Page R.C.: The role of inflammatory mediators in pathogenesis of periodontal disease, J. Periodontal. Res. 1991, 26, 3, 230-42. 2. Chang Y.C., et al.: Regulation of matrix metalloproteinase production by cytokines, pharmacological agents and periodontal pathogens in human periodontal ligament fibroblast cultures. J. Periodontal. Res. 2002, 37:196-203. 3.Unemori E.N., et al.: Constitutuve expression of a 92-kD gelatinase (type V collagenase) by rhumatoid synovial fibroblasts and its induction in normal human fibroblasts by inflammatory cytokines. J. Clin. Invest, 1991, 88, 1656-62. 4.Saren P., et al.: TNF-alpha and IL-1 beta selectively induce expression of 92 kDa gelatinase by human macrophages. J. Immunol. 1996, 157, 4159-65. 5.Johnatty R.N., et al.: Cytokine and chemokine regulation of proMMP-9 and TIMP-1 production by human peripheral blood lymphocytes, J. Immunol. 1997, 1, 2327-33. 6. Hanemaijer R., et al.: Matrix metalloproteinase-8 is expressed in rhumatoid synovial fibroblasts and endothelial cells. Regulation by TNFa and doxycycline, J. Biol. Chem. 1997, 272, 31504-31509. 7.Uchida M., et al.: Regulation of matrix metalloproteinase (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) by bone resorptive factors in osteoblastic cells, J. Cell. Physiol. 2000, 185, 207-14. 8.Overrall C.M., et al.: Trancriptional and post-transcriptional regulation of 72-kDa gelatinas/type IV collagenase by transforming growth factor-b1 in human fibroblasts, J. Biol. Chem. 1991, 266, 14064-71. 9.Salo T., et al.: Trnsforming growth factor-b1 up-regulates type IV collagenase expression in cultured human keratinocytes, J. Biol. Chem. 1991, 266, 11436-41. 10.Palosaari H., et al.: The expression of MMP-8 in odontoblasts and dental pulp cells is down regulated by TGF-b1, J. Dent. Res. 2000, 79, 77-84. 11.Ito A., et al.: Degradation of IL-1b by matrix metalloproteinases, J. Biol. Chem. 1996, 271, 14657-60. 12.Schonbeck U., et al.: Generation of biologically active IL-1b by matrix metalloproteinases: a novel caspase-1-independent pathway of IL-1b processing, J. Immunol. 1998, 161, 3340-3346. 13.Eberhardt W., et al.: Amplification of IL-1 beta-induced matrix metalloproteinase-9 expression by superoxide in rat glomerular mesangial cells is mediated by increased activities of NF-kappa B and activating protein-1 and involves activation of the mitogen-activated protein kinase pathways. J. Immunol. 2000, 165:5788-5797. 14.Chang Y.C., et al.: Regulation of MMPs and TIMPs by IL-1beta during corneal ulceration and infection. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003, 44, 2020-2025.

Nowa Stomatologia 3/2004
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia

Powrót na górę strony

Ocena korelacji pomiędzy poziomem IL-1b oraz metaloproteinazy – 8, 9 i TIMP-1 w krwi obwodowej pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia

Pozostałe artykuły z numeru 3/2004: