Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 12/2008, s. 828-833
*Anna Budzyńska, Agnieszka Kaczmarek, Eugenia Gospodarek
Diagnostyka molekularna bakteryjnych zakażeń krwi
Molecular diagnostics of bacterial blood infections
Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik Katedry: prof. UMK dr hab. med. Eugenia Gospodarek
Streszczenie
Metody biologii molekularnej uważa się za szybkie narzędzie do wykrywania i identyfikacji czynnika etiologicznego zakażenia, wyizolowanego w hodowli lub bezpośrednio w materiale klinicznym. Rozpoznanie bakteriemii i rozróżnienie gatunków bakterii za nią odpowiedzialnych jest możliwe dzięki zastosowaniu w reakcji amplifikacji uniwersalnych starterów komplementarnych do odcinka 16S rRNA lub starterów gatunkowo-swoistych. Chociaż techniki biologii molekularnej nie zastąpią konwencjonalnych metod, koniecznych do oznaczania lekowrażliwości, w niektórych przypadkach zaleca się je do identyfikacji patogenu.
Summary
Molecular methods are considered to be rapid tool for the detection and accurate identification of the etiological agent from cultures or directly from clinical material. Amplification with universal primers usually complementary to highly conserved region 16S rRNA or amplification species-specific sequence allows detection of bacteriemia and discrimination among different bacterial species. Conventional methods provide antibiotic susceptibility data so will not be replaced by molecular techniques but detection of bacterial DNA in some cases may be recommended to identify the pathogen.
Słowa kluczowe: bakteriemia, izolacja DNA, PCR, 16S rRNA.
Wstęp
Posocznica jako wynik zakażenia uogólnionego jest jedną z przyczyn zgonów wśród pacjentów hospitalizowanych. Wskaźnik śmiertelności wynosi 30-70% i zależy od wielu czynników związanych zarówno z patogenezą, stanem zdrowia pacjenta, jak i jakością procedur medycznych. Ponad 90% przypadków bakteriemii jest spowodowanych przez: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Candida spp. Obecność drobnoustrojów we krwi jest zazwyczaj wynikiem inwazyjnego zakażenia organizmu, które wymaga wprowadzenia antybiotykoterapii. Sukces w leczeniu zależy od właściwego rozpoznania patogenu oraz prawidłowego doboru antybiotyków, na które drobnoustrój wykazuje wrażliwość (1).
Ze względu na niewielką liczbę patogenów w pobieranej objętości krwi, istnieje konieczność prowadzenia wstępnej hodowli w podłożu namnażającym, a ich wykrywanie opiera się na wyniku skomputeryzowanego systemu, monitorującego poziom wytwarzania metabolitów specyficznych dla drobnoustrojów. Obecnie dostępne są trzy automatyczne systemy wykrywające mikroorganizmy we krwi: BacT/Alert (BioMérieux), BACTEC (Becton Dickinson) i Extra Sensing Power (Difco Laboratories). Od momentu wykrycia aktywności metabolicznej drobnoustrojów i w związku z tym odczytania przez system dodatniego wyniku posiewu krwi, w ciągu 1-3 dni identyfikowany jest czynnik etiologiczny zakażenia na podstawie badania mikroskopowego, hodowli na podłożach stałych oraz reakcji biochemicznych i immunologicznych. Jednak zarówno obecność więcej niż jednego czynnika etiologicznego zakażenia, jak i występowanie nietypowych biochemicznie lub antygenowo szczepów może prowadzić do niewłaściwej interpretacji wyniku, braku możliwości określenia gatunku patogenu rzadko spotykanego lub otrzymania wyniku fałszywie ujemnego (2, 3). Na uzyskanie fałszywie ujemnych wyników ma również wpływ obecność w surowicy chorego stosowanych antybiotyków, obecność drobnoustrojów niehodowlanych oraz pobranie niewystarczającej objętości i liczby próbek krwi. Pomimo, iż we krwi niektórych niemowląt z bakteriemią stwierdza się większą liczbę drobnoustrojów niż u dorosłych (odpowiednio, 10-300 i 1-30 CFU/ml), liczba pobieranych od nich próbek krwi jest znacznie niższa niż u dorosłego pacjenta, a im mniejsza objętość krwi, tym mniejsze szanse wykrycia patogenów (4). Częstość dodatnich posiewów krwi u dzieci przyjmowanych na oddział intensywnej terapii z objawami sepsy wynosi 25-26% (5, 6).
Wpływ na wynik hodowli mają substancje dodawane do podłoży namnażających. Przykładem jest polianetosulfonian sodowy (ang. sodium polyanetholesulfonate, SPS) stosowany jako czynnik hamujący krzepnięcie krwi i fagocytozę oraz aktywność przeciwbakteryjną surowicy poprzez wytrącanie frakcji dopełniacza. Może hamować wzrost takich drobnoustrojów, jak: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Francisella tularensis, Moraxella catarrhalis. Pomimo poczynań mających na celu ominięcie problemów związanych z wykryciem i identyfikacją czynnika etiologicznego zakażeń krwi, oczekiwanie na wynik hodowli jest zbyt długie, szczególnie w przypadku drobnoustrojów o wysokich wymaganiach odżywczych (7, 8).
Skrócenie czasu badania umożliwiłoby ograniczenie stosowania antybiotyków o szerokim zakresie działania, co z kolei zmniejszyłoby ryzyko pojawiania się szczepów wielolekoopornych. Jednocześnie obniżeniu uległyby koszty leczenia poprzez zastąpienie leczenia empirycznego antybiotykami o węższym i ukierunkowanym zakresie działania (3).
Uzyskanie w krótkim czasie wyniku badania mikrobiologicznego umożliwiają techniki biologii molekularnej, oparte na wykrywaniu DNA drobnoustrojów. Cechuje je większa czułość niż standardowe metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej. Wykorzystywane są najczęściej w celu potwierdzenia rozpoznania zakażenia Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serowar Typhi, Burkholderia pseudomallei, Borrelia burgdorferi, Coxiella burnetti, Mycobacterium tuberculosis, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumoniae. Techniki molekularne mogą być wykorzystywane w diagnostyce zakażeń krwi w przypadku tych pacjentów, u których podejrzewa się posocznicę, ale jednocześnie objawy kliniczne nie są typowe lub metody hodowlane wskazują wynik ujemny. Najczęściej stosowane techniki opierają się na reakcji amplifikacji (polymerase chain reaction, PCR) oraz hybrydyzacji.
Łańcuchowa reakcja polimerazy
Reakcja PCR polega na amplifikacji wybranego fragmentu DNA przy użyciu specyficznych starterów, które inicjują przyłączanie nukleotydów i powielanie łańcucha DNA, dzięki czemu możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale nawet minimalnych ilości poszukiwanego odcinka DNA. Detekcja opiera się na elektroforezie produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określeniu jego wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu. Właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia możliwa jest dzięki reakcji multipleks-PCR, w skład której wchodzi mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów drobnoustrojów. Metoda ta jest efektywna dla ograniczonej liczby mikroorganizmów, gdyż zwiększenie liczby par starterów może prowadzić do obniżenia czułości reakcji lub wystąpienia wyników fałszywie ujemnych.
Przeprowadzenie równolegle lub kolejno po sobie serii indywidualnych reakcji PCR zwiększa z kolei koszt i złożoność badania. Problemy te można ominąć stosując pojedynczą parę uniwersalnych starterów zaprojektowanych do konserwatywnego regionu DNA bakterii. Badania prowadzone są zwykle z użyciem starterów komplementarnych do odcinka 16S rybosomowego DNA (rDNA) kodującego podjednostkę 16S rybosomu, obecną wyłącznie w komórkach bakteryjnych. W obrębie genów kodujących 16S rRNA występują fragmenty cechujące się wysoką konserwatywnością, poprzedzielane regionami o dużym z reguły polimorfizmie. Analiza produktu PCR, zawierającego fragment sekwencji unikalnej dla rodzaju lub gatunku patogenu, umożliwia jego identyfikację. W diagnostyce molekularnej zakażeń wykorzystuje się również amplifikację regionu 16S-23S rDNA, którego sekwencja wykazuje większą zmienność międzygatunkową niż odcinek 16S rDNA (1, 9, 10). W większości przypadków reakcję amplifikacji przeprowadza się na próbkach z wynikiem dodatnim posiewu krwi na bulionie namnażającym, ale bezpośrednie wykrycie materiału genetycznego drobnoustrojów w próbce pobranej od pacjenta również przynosi pożądane wyniki i pozwala na szybkie włączenie leczenia (1).
Siondalski i wsp. (11) porównali skuteczność metody PCR i systemu BACTEC w wykrywaniu bakterii we krwi pacjentów przed i po operacji na otwartym sercu. Izolację materiału genetycznego drobnoustrojów wykonywano bezpośrednio z materiału pobranego od chorych. W celu stwierdzenia obecności bakterii zastosowano uniwersalne startery do amplifikacji konserwatywnego regionu 16S rDNA. Następnie próbki z dodatnim wynikiem PCR analizowano w kierunku określenia gatunku bakterii, używając w reakcji amplifikacji starterów specyficznych dla S. epidermidis, S. aureus i P. aeruginosa. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono większą czułość techniki PCR, w porównaniu z hodowlą krwi w systemie BACTEC. Odsetek próbek dodatnich wyniósł odpowiednio 11,3% i 3,8%. Wykluczono fałszywie dodatnie wyniki amplifikacji, ponieważ wydłużenie czasu inkubacji w systemie BACTEC pozwoliło potwierdzić bakteriemię. Stwierdzono również 100% specyficzność zastosowanej metody molekularnej, ponieważ wszystkie wymienione wyżej gatunki zostały prawidłowo zidentyfikowane (11). Z kolei Zhang i wsp. (12) zastosowali reakcję amplifikacji konserwatywnego regionu 16S rDNA do potwierdzenia posocznicy będącej komplikacją ostrego martwiczego zapalenia trzustki, w przebiegu której w ponad 50% przypadków stwierdza się brak udokumentowanego mikrobiologicznie zakażenia (13). Interpretacja wyników wykazała, że odsetek wyników dodatnich otrzymanych z hodowli krwi wynosił 4,6%, natomiast z reakcji PCR – 36,4%, co potwierdza większą czułość metody molekularnej.
Podobnie jak każda inna metoda diagnostyczna, również technika PCR ma wady. Przy jej użyciu, oprócz żywych patogenów, zdolnych do namnażania, wykrywa się również zabite lub pochłonięte przez fagocyty patogeny, co nie pozwala rozróżnić czynnego zakażenia od przebytego. Stąd konieczne staje się odniesienie wyniku reakcji amplifikacji do obserwacji klinicznych, aby móc ustalić obecność lub ustąpienie posocznicy (12). Objętość pobranej próbki materiału ma wpływ nie tylko na wyniki otrzymywane przy użyciu klasycznych metod mikrobiologicznego badania krwi, ale również na czułość reakcji PCR. Minimalna objętość krwi wymagana do amplifikacji na wykrywalnym poziomie fragmentu genu kodującego 16S rRNA wynosi 200 μl (7). Rozważając wady metody, należy wziąć też pod uwagę fakt, że zanieczyszczenie odczynników reakcji bakteryjnym DNA obecnym w środowisku prowadzi do otrzymania wyniku fałszywie dodatniego. W związku z tym, istnieje konieczność włączania w każdej reakcji amplifikacji kontroli ujemnej PCR. Przyczyną wyników fałszywie ujemnych mogą być również pojedyncze mutacje punktowe w genomie drobnoustrojów na odcinku stanowiącym sekwencję docelową dla starterów, co uniemożliwia inicjację reakcji amplifikacji.
Wpływ na wydajność metody amplifikacji ma obecność w próbce krwi inhibitorów reakcji PCR, które można podzielić na naturalne składniki krwi (związki hemu i DNA leukocytów) (14, 15) oraz dodawane do niej koagulanty (heparyna, EDTA) (16, 17). Powinny być one wcześniej zinaktywowane, rozpuszczone lub usunięte z pobranego materiału, np. przez dodanie do mieszaniny PCR 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,01% białka gp32, betainę (N, N, N-trimetyloglicyna) lub zwiększenie stężenia jonów Mg2+ (18, 19, 20). Standardowa technika ekstrakcji mieszaniną fenol-chloroform nie pozwala odpowiednio oczyścić bakteryjnego DNA i pozbyć się SPS, inhibitora PCR obecnego w podłożach BACTEC i BacT/Alert, co znacznie utrudnia szerokie stosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce zakażeń krwi (21).
Kolejnym problemem, który wiąże się z zastosowaniem techniki PCR w diagnostyce zakażeń krwi jest możliwość występowania w wysterylizowanych wcześniej podłożach namnażających bakteryjnego DNA, które przy zastosowaniu konserwatywnych starterów również ulega amplifikacji. W podłożu BACTEC wykryto silnie pofragmentowane DNA Bacillus spp., natomiast w podłożu BacT/Alert – Streptococcus spp. (21). W celu uniknięcia zafałszowania wyników, należy włączyć do reakcji PCR kontrolę prowadzoną na jałowym podłożu namnażającym.
Sekwencjonowanie
Analiza produktów amplifikacji fragmentu 16S rDNA o zmiennej sekwencji poprzez sekwencjonowanie i porównanie ich z danymi pochodzącymi z banku genów umożliwia identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia. Sekwencjonowanie polega na analizie sekwencji nukleotydów w namnożonym odcinku DNA. Wybór amplifikowanego regionu i jego długość mają wpływ na zdolność różnicowania blisko spokrewnionych mikroorganizmów. Badania wykazały, że metoda PCR w połączeniu z sekwencjonowaniem jest dwukrotnie czulsza od hodowli (22). Sleigh i wsp. (23) wykorzystali ją do wykrywania bakteriemii u pacjentów oddziału intensywnej terapii. Analiza wyników wykazała, że 2/3 dodatnich reakcji PCR zostało prawidłowo zinterpretowanych. Pozostałe stanowiły prawdopodobnie wyniki fałszywie dodatnie, które mogły być spowodowane zanieczyszczeniem krwi podczas jej pobierania.
Sekwencjonowanie fragmentów genów 16S rDNA w celu ich identyfikacji wiąże się z dużymi nadziejami szybkiego wykrywania drobnoustrojów ze względu na precyzję metody. Aktualnie nie jest rekomendowane w diagnostyce mikrobiologicznej z powodu kosztów. Ponadto, jest niewiarygodne w przypadkach zakażeń mieszanych, ponieważ nie uzyskuje się jednoznacznego odczytu sekwencji zamplifikowanych produktów (23).
Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2008-05-09
zaakceptowano do druku: 2008-09-26

Adres do korespondencji:
*Anna Budzyńska
ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, 85-094 Bydgoszcz
tel.: (0-52) 585-44-80
e-mail: kizmikrob@cm.umk.pl

Postępy Nauk Medycznych 12/2008
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych