Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2014, s. 23-27
Janina Drozd, *Elżbieta L. Anuszewska
Działanie immunostymulujące wodnego wyciągu z liści aloesu drzewiastego (Aloe arborescens Mill.)
Immunostimulatory activity of water extract from leaves of Aloe arborescens Mill.
Zakład Biochemii i Biofarmaceutyków, Narodowy Instytut Leków w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. farm. Elżbieta L. Anuszewska
Summary
Genus Aloe was traditionally applied for the medicinal practice over thousands of years and used for treatment of wide range of medical indication from stomach disorders to cancer. Fresh leaves of Aloe arborescens contain various groups of chemical compounds such as: glycoproteins, polysaccharides, hydroxyanthraquinone derivatives, vitamins, minerals, aminoacids and many others, which show multidirectional therapeutic action. These active components are responsible for immunomodulatory, antiinflammatory and antimicrobial effects of Aloe arborescens.
Therefore the aim of our study was to demonstrate that water Aloe arborescens extract positively affects the survival of mouse thymocytes in cultures with hydrocortisone (cytotoxicity test) and increases the count of splenocytes forming spontaneous rosettes with sheep red blood cells (E-rosette test ).The immature thymocytes have steroid receptors on their surface, therefore being sensitive to the lytic action of hydrocortisone, which induces an active process of autodestruction leading to apoptosis. During maturation and obtainment of immunological power the cells lose these receptors and become resistant to steroids. The ability of splenocytes to bind sheep erythrocytes to form spontaneous resettes depends on the binding of glycoprotein structures present on the surface with lipids present on the surface of sheep red blood cells.
The obtained results show that water Aloe arborescens extract increases survival rate of Balb-c mouse thymocytes in cultures with hydrocortisone and increases the ability of splenocytes to attach to sheep erythrocytes in E-rosette test. Comparison of the results for water extract from the Aloe arborescens leaves with those obtained for synthetic immunostimulators: levamisol and isoprinosine, shows no differences between the immunostimulatory activity of both.
Wstęp
Aloes drzewiasty (Aloe arborescens Mill.) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych gatunków z rodzaju Aloe L. Z uwagi na szerokie zastosowanie w przemyśle żywnościowym, kosmetycznym i farmaceutycznym, poza stanowiskami naturalnymi, uprawiany jest na plantacjach, głównie w Japonii, Chinach, obu Amerykach, a także w Polsce. Liście aloesu zawierają do 98% wody; w pozostałych kilku procentach zawartości znajduje się duża liczba biologicznie aktywnych składników (1, 2). Od dziesiątków lat preparaty aloesowe stosowane są w profilaktyce i terapii ludzi i zwierząt, w szeregu takich chorób, jak zakażenia bakteryjne i wirusowe, rany i owrzodzenia oraz choroby układu pokarmowego (3-8). Właściwości przeciwutleniające i stymulujące układ odpornościowy aloesu drzewiastego wykorzystywane są także w profilaktyce i leczeniu wspomagającym chorób cywilizacyjnych; cukrzycy i nowotworów (9, 10).
Od lat pięćdziesiątych na terenie Polski dopuszczony do obrotu jest produkt leczniczy o nazwie Biostymina; płyn doustny, będący wodnym wyciągiem z liści aloesu drzewiastego, pochodzącego z hodowli własnej Zakładów Zielarskich Phytopharm Klęka S.A. Liście roślin trzyletnich po procedurze mycia poddaje się bioaktywacji zgodnie z teorią Fiłatowa. Zakłada ona, że przechowywanie w zimnie i w ciemności powoduje powstanie biogennych stymulatorów w tkankach roślinnych, odpowiedzialnych za efekty terapeutyczne (8). Po okresie bioaktywacji, rozdrobnione liście poddaje się ekstrakcji wodą redestylowaną, na drodze gotowania przez okres 10-20 min. Ekstrakty wodne po filtracji i sterylizacji są ampułkowane i wyjaławiane.
Biostymina stosowana jest najczęściej w profilaktyce i leczeniu zakażeń górnych dróg oddechowych (1, 4, 6). Warto zaznaczyć, że działanie immunostymulujące Biostyminy zależne jest od dawki i drogi podania.
Cel pracy
Celem pracy jest potwierdzenie immunostymulującego działania Biostyminy otrzymywanej w aktualnym procesie wytwarzania i porównanie jej działania z aktywnością syntetycznych immunostymulatorów. Do oceny działania immunostymulującego zastosowano testy: cytotoksyczności z hydrokortyzonem i rozetowy, przy czym prawidłowe przeprowadzenie immunizacji zwierząt sprawdzano za pomocą testu hemaglutynacji.
Materiały i metody
Zwierzęta
Myszy szczepu wsobnego Balb-c, samice, w wieku 4 tyg. o masie ciała ok. 16 g (test cytotoksyczności) oraz 6-8 tyg. o masie ciała ok. 20 g (test tworzenia rozet E i test hemaglutynacji czynnej). Zwierzęta pozyskiwano z hodowli Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny. Doświadczenia z udziałem zwierząt wykonano za zgodą IV Lokalnej Komisji Etycznej; nr 47/2013 (06/NIL/2010).
Płyny hodowlane
Podłoże hodowlane RPMI-1640, z dodatkiem Hepes 20 mM/l (IITD Wrocław);
Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej, PBS (IITD Wrocław);
Płyn Hanksa z dodatkiem 0,5% hydrolizatu laktoalbuminy (IITD Wrocław).
Odczynniki
Hydrokortyzon – (Corhydron) 100 mg, proszek i rozpuszczalnik (Jelfa);
Krwinki czerwone owcy (SRBC), GRASO Biotech, stabilizowane w płynie Alsewera;
Płyn Alsewera: glukoza, cytrynian sodu, chlorek sodu, kwas cytrynowy (wszystkie odczynniki POCH);
Izofluran – (AErrane), płyn (Baxter); Surowica cielęca płodowa (Bioprodukt); Błękit trypanu, substancja (Merck); Fiolet krystaliczny, substancja (Merck); Gradisol L o gęstości 1,077 g/ml (Aqua Medica).
Immunostymulatory
Biostymina, płyn doustny (Phytopharm, Klęka);
Produkt leczniczy Biostymina podawano w teście cytotoksyczności, w dawkach: 2, 4, 6 i 8 μl/ml hodowli; w teście hemaglutynacji i rozetowym w dawkach: 2 i 4 μl/mysz (podanie doustne) (1);
Isoprinosine, substancja (Synthelabo); Levamisole hydrochloride, substancja (Sigma). Oba związki stosowano w stężeniach: 1,00; 0,10 i 0,01 mg/ml hodowli (11).
Test cytotoksyczności
W teście oceniano wpływ danego czynnika na przeżywalność tymocytów myszy w 18-20 godz. hodowlach z hydrokortyzonem (12). Niedojrzałe tymocyty mają na swojej powierzchni receptory dla sterydów, przez co są wrażliwe na lityczne działanie hydrokortyzonu, który indukuje aktywny proces autodestrukcji i wywołuje apoptozę (13, 14). Podczas dojrzewania i nabywania przez limfocyty kompetencji immunologicznych, komórki tracą te receptory i stają się sterydooporne. Hodowle tymocytów są dobrym modelem doświadczalnym dla szybkiej oceny czynników mogących przyspieszać dojrzewanie limfocytów T, a więc wywierających działanie tymomimetyczne, podobne do działania hormonów grasicy.
Myszy usypiano izofluranem i pobierano jałowo grasice, które następnie przecierano przez metalowe sito (średnica oczek około 300 μm, produkcji firmy Sigma). Tymocyty otrzymane z rozdrobnionych grasic przepłukiwano trzykrotnie RPMI-1640 i wirowano (1800 obr./min przez 7-8 min). Po ostatnim wirowaniu tymocyty w liczbie 4x106 komórek/ml zawieszano w RPMI z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Zawiesinę tymocytów rozlewano po 1 ml do jałowych probówek i dodawano po 2, 4, 6 lub 8 μl Biostyminy lub lewamizol i izoprynozynę w stężeniu: 1,00; 0,10 i 0,01 mg/ml. Po upływie 1 godz. dodawano hydrokortyzon w dawce 50 μg/ml hodowli tymocytów. Tak przygotowane próby inkubowano przez 18-20 godz. w temp. 37°C w atmosferze CO2. Po tym czasie obliczano dla każdej hodowli liczbę żywych i martwych komórek po zabarwieniu 0,04% roztworem błękitu trypanu. Test przeprowadzano w warunkach jałowych.
Warunkiem prawidłowo przeprowadzonego doświadczenia jest odpowiednia żywotność tymocytów. Pod mikroskopem liczono 100 komórek, oddzielnie żywe i martwe. Odsetek komórek żywych w kontroli bez hydrokortyzonu powinien wynosić powyżej 80%; w przeprowadzonych badaniach żywotność tymocytów w hodowlach kontrolnych wynosiła od 86,3-91,3%. Względna przeżywalność komórek (stosunek komórek żywych w hodowli z hydrokortyzonem do komórek żywych w kontroli powinien mieścić się w granicach 50-65%) wynosiła średnio 56,93% (względna przeżywalność komórek poniżej 50% lub powyżej 65% dyskwalifikuje doświadczenie). Wyniki przeliczano jako procentowy wzrost (lub spadek) liczby żywych komórek w hodowlach z badanymi czynnikami w stosunku do hodowli z hydrokortyzonem.
Test rozetowy
Przyjmuje się, że wszystkie limfocyty T mają receptory dla krwinek czerwonych owcy (15, 16). Zdolność limfocytów T do łączenia się z krwinkami owcy i tworzenia z nimi spontanicznych rozet (tzw. rozet E) zależy od wiązania się struktur glikolipidowych na powierzchni błony komórkowej limfocytów z lipidami powierzchniowymi erytrocytów owcy. Wszystkie czynności związane z testem wykonywano w lodzie. Wirowanie prowadzono w wirówce z chłodzeniem.
Myszom, w celu immunizacji, podawano dootrzewnowo jednorazową dawkę 4x108 erytrocytów owcy (SRBC) (17). Zwierzęta kontrolne otrzymywały PBS. Biostyminę podawano doustnie w dawkach 2 i 4 μl/mysz. W 5 dniu po immunizacji myszy usypiano izofluranem i pobierano śledzionę, którą używano następnie do wykonania testu rozetowego. Otrzymane ze śledziony splenocyty homogenizowano, nawarstwiano na Gradisolu L o gęstości 1,077 g/ml i wirowano 15 min przy 3000 obr./min. Uzyskane z granicy faz limfocyty dwukrotnie płukano w płynie Hanksa, ponownie wirowano i zawieszano w podłożu, uzyskując końcową liczbę komórek 2x106/ml hodowli. Dla każdej próby określano procent splenocytów martwych (obecność martwych komórek w ilości powyżej 10% dyskwalifikuje próbę do dalszych badań). Następnie do hodowli splenocytów dodawano 1% zawiesiny SRBC w płynie Hanksa. Po 15 min inkubacji w temp 37°C hodowle inkubowano 20 godz w temp 4°C. Po zabarwieniu 0,1% roztworem fioletu krystalicznego zliczano pod mikroskopem odsetek splenocytów, wokół których utworzyły się rozety (za rozetę uważano splenocyt otoczony co najmniej trzema erytrocytami owcy). Dla każdego badania testem rozetowym wykonywano test hemaglutynacji, jako kontrolny test prawidłowo wykonanej immunizacji. Użyte do testu rozetowego myszy były również źródłem surowicy.
Wyniki uzyskane w teście cytotoksyczności i rozetowym poddano ocenie statystycznej, obliczając SE – standardowy błąd średniej oraz statystyczną istotność różnic dla dwóch prób powiązanych (program Medistat).
Test hemaglutynacji wg Adlera (17) w modyfikacji własnej (18)

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2014-02-20
zaakceptowano do druku: 2014-02-28

Adres do korespondencji:
*prof. dr hab. n. farm. Elżbieta Anuszewska
Zakład Biochemii i Biofarmaceutyków Narodowy Instytut Leków
ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa
tel./fax: +48 (22) 841-54-31
e-mail: e.anuszewska@nil.gov.pl

Postępy Fitoterapii 1/2014
Strona internetowa czasopisma Postępy Fitoterapii