Zjawiska immunologiczne w autoagresyjnym zapaleniu wątroby (AIH)

Klasyfikacja patogenetyczna chorób z autoagresji opiera się na: a) uogólnionym defekcie w zakresie selekcji limfocytów T i B lub zaburzeniach ich homeostazy, b) nieprawidłowej odpowiedzi limfocytów tylko na określone antygeny.

Limfocyty nawet w warunkach fizjologicznych ulegają ciągłej stymulacji przez autoantygeny i uzyskany tą drogą odpowiedni poziom ich aktywacji zapewnia optymalne funkcjonowanie układu odpornościowego (np. synteza przeciwciał naturalnych). Autoantygeny są pomocne w kształtowaniu repertuaru swoistości dojrzałych limfocytów oraz zwiększaniu ich przeżywalności.

Zakres reaktywności limfocytów na autoantygeny (fizjologiczny lub patologiczny) zależy w znacznej mierze od mikrośrodowiska (kształtowanego przez czynniki genetyczne oraz uwarunkowania endogenne i egzogenne) w którym dochodzi albo do fizjologicznej aktywacji limfocytów lub do rozwinięcia niekontrolowanych aktywności autoagresyjnych (1).

Czynnościowo układ odpornościowy składa się z tzw. systemu odporności nieswoistej lub wrodzonej i systemu odporności swoistej. System odporności nieswoistej (filogenetycznie starszy) składa się z komórek (monocyty, makrofagi, komórki dentrytyczne, granulocyty, komórki tuczne, limfocyty NK) i białek takich jak (dopełniacz, cytokiny, białka ostrej fazy). Układ odporności nieswoistej jest ściśle powiązany czynnościowo z układem odporności swoistej.

System odporności swoistej tworzą limfocyty T i B. Są to wysoce zróżnicowane populacje komórek limfoidalnych, pochodzacych ze wspólnej komórki macierzystej, różnicujące się w centralnych narządach limfoidalnych, tj. w grasicy (T limfocyty) i w szpiku kostnym (B limfocyty). W wyniku różnicowania limfocytów oraz ich selekcji powstają immunokompetentne limfocyty T i B wykazujące ekspresję receptorów błonowych zdolnych do rozpoznania jedynie obcych antygenów, a tolerowania własnych.

Optymalna aktywacja dziewiczych limfocytów T lub B wymaga dwóch sygnałów: a) antygenowo swoistego sygnału I, zachodzącego w wyniku interakcji epitopów antygenu z rozpoznającym je receptorem limfocytarnym, b) antygenowo niespecyficznego, tj. kostymulującego sygnału II, indukowanego zarówno poprzez bezpośredni wzajemny kontakt limfocytów B i T oraz limfocytów T z innymi komórkami (tzw. komórkami prezentującymi antygen-APC), jak i działanie rozpuszczalnych czynników białkowych, tzw. cytokin, syntetyzowanych zarówno przez limfocyty jak i APC.

Zróżnicowane, efektorowe pomocnicze komórki T CD4+ (Th) dzielą się na trzy populacje różniące się profilem syntezy cytokin, tj. komórki Th1 (syntetyzują IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa), Th2 (syntetyzują IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) i Th3 (syntetyzują IL-10 i TGF-beta). Cytokiny Th1 działają prozapalnie i uczestniczą przede wszystkim w reakcjach typu komórkowego, cytokiny Th2 uczestniczą w reakcjach humoralnych (synteza przeciwciał IgG i IgE), cytokiny Th3 uczestniczą w wygaszaniu reakcji odpornościowych (po eliminacji antygenu) i utrzymywaniu tolerancji.

W przeciwieństwie do limfocytów T komórki immunokompetentne B mogą wiązać wolne antygeny poprzez receptor dla antygenu (sygnał I) i jednocześnie prezentować immunogenne peptydy limfocytom T CD4+ (sygnał II). Limfocyty T działają w ten sposób jako komórki pomocnicze w syntezie przewciwciał o różnej swoistości.

Wzajemna równowaga w zakresie oddziaływania sygnału I i II ma kluczowe znaczenie dla przebiegu odpowiedzi odpornościowej. W wypadku działania sygnału I, lecz przy słabym sygnale II lub jego braku dochodzi odpowiednio albo do anergii limfocytów (areaktywności na antygen) lub ich śmierci (apoptoza). Zjawisko braku lub osłabienia tolerancji na autoantygeny w chorobach z autoagresji zależy w znacznej mierze od współdziałania sygnału I i II (2).

Wątroba dorosłego człowieka o masie 1,5 kg zawiera około 10¹⁰ limfocytów (około 1-2 milionów/200 mg). Funkcje metaboliczne i sekrecyjne wątroby zależą od komórek parenchymy (hepatocytów i przewodów żółciowych), stanowiących 70% składu komórkowego wątroby. Pozostałe 30% stanowią komórki nieparenchymalne (NPC), związane z aktywnością immunologiczną wątroby. W skład NPC wchodzą: komórki endotelium (50%), limfocyty (25%), makrofagi wątrobowe – komórki Kupfera (20%), komórki epitelium dróg żółciowych (BEC – 5%).

Komórki endotelium zatok wątrobowych – liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) syntetyzują szereg cytokin i wykazują konstytutywną ekspresję molekuł adhezyjnych takich jak ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) i CD58 (LFA-3), cząsteczek kostymulacyjnych CD80, CD86, antygenów HLA-klasy I i II, oraz (po stymulacji) adhezynę VCAM-1, cząsteczki kostymulacyjne CD80, CD86 białka Fas (CD95) i ligandy CD95 L. Ekspresja adhezyn umożliwia: a) selektywne wyłapywanie aktywowanych limfocytów T (głównie CD8+), napływających do wątroby po zakończeniu odpowiedzi odpornościowej na czynnik stymulujący; większość z nich ulega apoptozie, b) prezentację egzogennych antygenów limfocytom T (CD4+ i CD8+), bez uprzedniej aktywacji LSEC przez cytokiny (cecha unikatowa dla komórek endotelium naczyniowego). Kontakt preaktywowanych przez antygen limfocytów z LSEC powoduje indukcję tolerancji na ponowny kontakt z antygenem (poprzez styntezę cytokin takich jak IL-10 i TGF-b). Ważną rolę w kontrolowaniu prezentacji antygenów limfocytom T mają także inne czynniki mikrośrodowiskowe takie jak LPS, pochodzący z komensalnej flory bakteryjnej. LPS w sposób ciągły indukuje syntezę IL-10 z komórek Kupfera, co hamuje z kolei zdolność LSEC do prezentacji antygenów limfocytom T.

Komórki Kupfera są wędrującymi makrofagami przytwierdzonymi do warstwy komórek LSEC. Pełnią ważną rolę jako APC. Komórki te ulegają aktywacji przez czynniki infekcyjne, takie jak endotoksyny bakteryjne (LPS), superantygeny. Uwalniają białka ostrej fazy i cytokiny (głównie IL-12 i TNF-alfa), co z kolei aktywuje komórki NK i aktywności typu Th1.

Komórki BEC wyściełające wewnątrzwątrobowe i zewnątrzwątrobowe przewody żółciowe wpływają na przepływ żółci z wątroby do dwunastnicy. Zarówno żółć jak i BEC wykazują aktywności immunologiczne; żółć zawiera znaczne ilości immunoglobulin, szczególnie IgA. Komórki BEC syntetyzują chemokiny i cytokiny, wykazują ekspresje szeregu molekuł adhezyjnych i kostymulacyjnych, zwłaszcza CD40, co oznacza, że mogą działać jak profesjonalne APC.

Skład subpopulacji limfocytów rezydujacych w wątrobie (intrahepatic lymphocytes – IPH) jest całkowicie odmienny od dystrybucji subpopulacji limfocytów w obwodowych narządach limfoidalnych i krwi krążącej. Generalnie, IPH są bogate w komórki zdolne do funkcjonowania jako nieswoiste limfocyty cytotoksyczne (NK, NKT, NKR-T) oraz do syntezy cytokin wytwarzających mikrośrodowisko w którym kontakt immunokompetentnych limfocytów z antygenem preferuje rozwój odpowiedzi typu Th1 lub Th2. Natomiast populacja dojrzałych immunokompetentnych limfocytów T i B w wątrobie jest relatywnie niewielka.

Populacja limfocytów wątroby zawiera: aż 55% komórek NK (tylko 5% we krwi), jedynie 25% klasycznych limfocytów T, tj. z ekspresją receptora TCRab (ponad 70% we krwi), lecz ponad 10% limfocytów T z ekspresją receptora TCR gd (tylko 3% we krwi), 5% B limfocytów (10% we krwi), oraz około 1% pluripotencjalnych komórek macierzystych (praktycznie brak we krwi).

Populacja klasycznych limfocytów T (TCR ab+) wątroby zawierają: aż 60% limfocytów T CD8+ (tylko 20% we krwi obwodowej) i jedynie 20% limfocytów T CD4+ (40% we krwi obwodowej) oraz 20% tzw. komórek TCR-low DN, tj. limfocytów T o niskiej ekspresji TCR i nie wykazujących koreceptorów CD4 i CD8.

Liczna populacja komórek NK w wątrobie jest niezwykle zróżnicowana fenotypowo, tj. obok klasycznych limfocytów NK o fenotypie CD3-TCR-CD56+, występują też limfocyty, które obok receptorów typowych dla komórek NK wykazują też obecność niektórych receptorów typowych dla komórek T. Komórki NK spontanicznie eliminują komórki nowotworowe, oraz komórki zakażone wirusami i bakteriami. Aktywowane (przez IL-12) komórki NK syntetyzują IFN-γ, który ułatwia różnicowanie dziewiczych komórek CD4+ w kierunku limfocytów Th1 oraz IL-5, która stymuluje proliferację i różnicowanie eozynofilów. W odróżnieniu od immunokompetentnych limfocytów T i B limfocyty NK nie posiadają błonowych receptorów specyficznie rozpoznających antygen, lecz wykazują ekspresję szeregu innych receptorów błonowych o konserwatywnej strukturze (receptory naturalnej cytotoksyczności), zdolnych do wiązania się z różnymi strukturami powszechnie występującymi w błonie komórkowej wielu typów komórek. Generacja limfocytów NK w wątrobie zależy od lokalnej syntezy IL-15, a ekspansja od IL-15, IL-18 i IL-2. Cytotoksyczność limfocytów NK wzmagana jest przez wiele cytokin (interferony, IL-12, IL-18, IL-21). Niekontrolowany wzrost ich aktywności powoduje reakcje zapalne (wirusowe lub autoagresyjne zapalenie wątroby). W wątrobie występuje też bardzo licznie reprezentowana populacja limfocytów, która wykazuje ekspresję receptorów typowych dla komórek NK, lecz także receptora TCR (T-cell receptor) o ograniczonym repertuarze swoistości. Receptor TCR tych komórek rozpoznaje glikolipidowe składowe błon komórkowych bakterii (fosfolipidy inozytolowe, kwasy mykolowe, etc), prezentowane przez niepolimorficzne cząsteczki CD1a,b,c,d (nieklasyczne MHC-klasy I). Komórki NKT syntetyzują cytokiny Th1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α) oraz Th2 (tj. IL-4), oraz jednocześnie IL-4 i IFN-γ (profil Th0), co jest wyjatkową ich cechą. Wykazują silną aktywność cytototoksyczną (bez restrykcji MHC), która wzmagana jest działaniem cytokin Th1. Limfocyty NKR+ T mają niektóre cechy fenotypowe charakterystyczne dla komórek T pamięci immunologicznej, co wskazuje, że łączą w sobie cechy zarówno komórek układu odporności nieswoistej jak i swoistej.

Charakterystyczną cechą wątroby jest występowanie niezwykle licznej populacji limfocytów T wykazujących ekspresję receptorów TCRgd (do 35% całkowitej puli komórek T). Większość z nich posiada także koreceptor CD8 oraz receptory typowe dla komórek NK. Rola komórek T z ekspresją TCRgd w wątrobie nie jest znana. Ich liczna reprezentacja potwierdza przewagę wrodzonych, nieswoistych aktywności układu odpornościowego wątroby nad mechanizmami odporności adaptacyjnej. Aktywowane limfocyty TCRgd syntetyzują cytokiny typu Th1 i Th2 i wykazują silne działanie cytotoksyczne bez restrykcji MHC. Limfocyty z ekspresją TCRgd uczestniczą w szybkim usuwaniu bakterii oraz komórek zakażonych wirusami oraz komórek nowotworowych. Mają działanie immunosupresyjne, blokując aktywację limfocytów T przez antygen.

Pomimo przewagi komórek o potencjalnych zdolnościach cytotoksycznych układ odpornościowy wątroby wykazuje unikalną zdolność tolerowania ogromnej ilości obcych swoistości zarówno na autoantygeny (produkty komensalnej flory bakteryjnej, materiał komórkowy pochodzący z rozpadłych komórek fizjologicznie usuwanych w wątrobie), jak i antygeny obce (głównie z układu pokarmowego). Potrzeba utrzymania stanu tolerancji przy jednoczesnej konieczności eliminowania patogenów jest przyczyną przewagi w prawidłowej wątrobie komórek czynnościowo zbliżonych do układu odporności nieswoistej, co ogranicza możliwość rozpoznawania jako obcych wielu swoistości antygenowych, przy zachowaniu możliwości ich eliminacji w sposób nieswoisty (3).

Jest to samoistne, przewlekłe zapalenie wątroby, spowodowane utratą tolerancji komórek układu odpornościowego na antygeny tkanki wątrobowej, prowadzące do destrukcji parenchymy wątroby, przebiegające z hypergammaglobulinemią, zwłaszcza klasy IgG i obecnością krążących autoprzeciwciał. Chorują głównie kobiety, niezależnie od wieku. Występuje silna immunogenetyczna assocjacja AIH z ekspresją haplotypów HLA A1-B8-DR3 lub DR4 oraz tendencja do współistnienia innych zespołów autoagresyjnych pozawątrobowych takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, wrzodziejące zapalenie jelita grubego oraz często obciążony wywiad rodzinny w kierunku chorób autoagresyjnych lub alergiczmych.

Profil autoprzeciwciał w surowicy (seropozytywność przy mianie > 1:80) jest podstawą klasyfikacji AIH na trzy grupy: AIH typu I (najbardziej powszechny), oraz AIH typu II i III (występujące rzadko).

– AIH typu I: przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) i przeciwko mięśniom gładkim (SMA) swoiste dla aktyny F, przeciwko antygenom cytoplazmatycznym neutrofili (pANCA). Jednoczesne ich występowanie w znacznym stopniu uwiarygodnia rozpoznanie.

Przeciwciała ANA są najbardziej niespecyficznym markerem AIH, gdyż występują także w PBC, PSC, wirusowych zapaleniach wątroby, zapaleniach polekowych i poalkoholowych wątroby oraz innych chorobach autoagresyjnych, zwłaszcza SLE. Antygenami dla ANA są centromery, ribonukleoproteiny, cyklina A, i wiele innych składników jądra komórkowego, błon jądrowych i DNA. Określone swoistości ANA nie korelują jednak ani z ich wartością diagnostyczną ani prognostyczną. Znaczenie patogenetyczne autoantygenów rozpoznawanych przez ANA nie jest znane.

Przeciwciała SMA wykazują swoistość przeciwko aktynowym jak i nieaktynowym komponentom (tubulina, vimentyna, desmina). Często występują w wysokim mianie razem z ANA, i podobnie jak ANA są wykrywane w wielu innych autoagresyjnych jednostkach chorobowych. Wartość diagnostyczna SMA w AIH wzbudza kontrowersje z powodów technicznych, ponieważ istnieją trudności z wykazaniem czy istotnie rozpoznają one mikrofilamenty F aktyny, a nie inne filamenty (vimentyna, tubulina). Autoantygen F aktyna występuje pod błoną komórkową komórek wątrobowych i mógłby stanowić cel ataku limfocytów cytotoksycznych. Struktura molekularna autoepitopów F aktyny nie jest znana i dlatego nie można określić specyficzności potencjalnie autoreaktywnych komórek.

Przeciwciała pANCA występują w surowicy 65-95% chorych z AIH typu I, oraz u chorych z PSC. Wyróżnia się dwa typy ekspresji ANCA: c ANCA – rozproszony typ immunofluorescencji w cytoplazmie granulocytów i p ACNA – immunofluorescencja w obszarze okołojądrowym cytoplazmy. U chorych z AIH zwykle występuje świecenie typu p ACNA i p.ciała ACNA i nie wykazują reaktywności z mieloperoksydazą (silny autoantygen). Specyficzny antygen dla przeciwciał ANCA nie jest znany.

– AIH typu II: przeciwciała antymikrosomalne swoiste dla wątroby i nerek (LKM-1), rozpoznające cytochrom P45O 2D6 oraz (z mniejszą częstością) przeciwciała przeciwko UDP-glukuronylotransferazom (UGT), przeciwciała antycytolowe typu 1 (LC1).

Autoprzeciwciała antymikrosomalne LKM stanowią heterogenną grupę przeciwciał o wielu swoistościach antygenowych i związane są nie tylko z AIH, lecz z wieloma innymi chorobami wątroby o podłożu immunologicznym (zapalenia polekowe, hepatitis C i D). Przy nieobecności SMA, ANA i SLA/LP uważane są jako marker AIH typu II. Przeciwciała LKM-1 wykazują swoistość przeciwko krótkiemu linearnemu epitopowi monooksygenazy cytochromowej P450 IID6 (CYP2D6), blokują aktywność CYP2D6 in vitro, stymulują limfocyty T pochodzące z nacieku zapalnego w wątrobie, rozpoznają niektóre inne epitopy (konformacyjne), występujące u chorych z hepatitis C i zakażeniach indukowanych wirusem herpes simplex typu 1. Przeciwciała LKM-2 występują w polekowym zapaleniu wątroby (indukowanym tikrynafenem). Przeciwciała LKM-3 wykazują reaktywność anty-1 uridyno 5´-dwufosfoglukuronylotransferaz (UGTA1A), tj. rodzinie enzymów metabolizujących leki. Po raz pierwszy opisano je u pacjentów z hepatitis D, później także u chorych z AIH. Przeciwciała LKM wykazują także szereg innych swoistości przeciwko niezidentyfikowanym antygenom o c. cz 35,57,59 i 50 kDa, występujących u chorych z AIH, HCV, oraz w zapaleniu wątroby indukowanym przez halotan.

Przeciwciała anty-LC1 występują u ponad 50% pacjentów z AIH typu II. Z mniejszą częstością występują u chorych z AIH typu I, razem z SMA i ANA oraz u chorych z wirusowym zapaleniem wątroby typu C. U 10% chorych z AIH przeciwciała anty-LC1 są jedynym markerem serologicznym. Antygenem dla przeciwciał LC1 jest cyklodeaminoformiminotransferaza (FTCD). Jest to enzym indukujący przejście histydyny do kwasu glutaminowego, wykazujący najwyższą ekspresję w wątrobie. Surowice z aktywnościami LC1 rozponają wiele epitopów tego antygenu. W przeciwieństwie do innych przeciwciał występujących u chorych z AIH obecność anty-LC1 koreluje z aktywnością choroby i może stanowić marker przetrwałego zapalenia w AIH.

-AIH typu III: przeciwciała przeciwko rozpuszczalnym antygenom wątroby i trzustki (SLA/LP). Przeciwciała anty-SLA/LP występują u 10-30% pacjentów z AIH. Dla różnicowania z PBC oznacza się poziom przeciwciał anty-mitochondrialnych (AMA), a kiedy test jest pozytywny wykonuje się badanie na obecność podjednostki E2 dehydrogenazy pirogronianowej lub ketonowej.

Histologiczne cechy AIH są charakterystyczne, lecz brak jest cech na tyle typowych aby na ich podstawie postawić rozpoznanie AIH. Obraz histologiczny wskazuje na zapalenie w przestrzeniach okołobramnych, nacieki limfocytów, komórek plazmatycznych, ogniska martwicy, włóknienie.

Czynniki genetyczne są istotne dla patogenezy AIH, lecz nie zidentyfikowano pojedynczego locus genetycznego wyraźnie determinującego przebieg AIH. Wskazuje się na rolę niektórych haplotypów HLA takich jak DRB1*301 i DRB*0401 jako niezależnych czynników determinujących skłonność do rozwoju AIH u pacjentów w Europie Północnej. Dotyczy to także polimorfizmu antygenu cytotoksycznych komórek T (CTLA 4*2) oraz receptora komórkowego witaminy D (VDR).

W rozpoznaniu należy wykluczyć ewentualne zakażenie wirusami hapatotropowymi typu A, B, C, CMV, Epstein-Barr i grupy herpes, oraz zmiany zapalne pochodzenia nieinfekcyjnego wywołane lekami hepatotoksycznymi, alkoholem lub reakcjami uczuleniowymi (4, 5).

Pomimo zidentyfikowania szeregu autoprzeciwciał o różnej swoistości i nawet poznania struktury molekularnej niektórych autoantygenów (np. cytochrom P450 2D6; epitop CYP450 2D6) czynniki inicjujące AIH nie są poznane, a obecność autoprzeciwciał ma jedynie znaczenie diagnostyczne. Również badania komórkowe niewiele wniosły co do poznania patogenezy choroby, a jedynie pozwoliły ustalić pewne charakterystyczne cechy reaktywności typu komórkowego u chorych z AIH, wtórnie indukowane przez proces chorobowy: 1) rozpoznawanie przez limfocyty T krwi obwodowej i klony komórek T pochodzące z bioptatów wątroby receptora asialoglikoproteinowego (ASGPR), przy obecności autoprzeciwciał antiyASPGR w surowicy, 2) naciek limfocytarny w wątrobie chorych z AIH jest wzbogacony w limfocyty T CD4+, 3) limfocyty CD4+ krwi obwodowej i wątroby, rozpoznające autoantygen LKM-1 wykazują fenotyp Th1, 4) okresy spontanicznej remisji wiążą się z powstaniem antygenowo swoistej i nieswoistej immunosupresji.

Eksperymentalne AIH indukowane na modelu zwierzęcym, chociaż nie w pełni odpowiadające AIH wskazują na udział limfocytów T CD4+ oraz komórek NKT w inicjowaniu choroby i przełamywaniu tolerancji. Badania te wykazały że:

1) limfocytami inicjującymi proces autoagresji są limfocyty T CD4+ oraz NKT,

2) aktywacja tych komórek powoduje masywną syntezę cytokin Th1 (IFN-γ TNF-α),

3) ich obecność wzmaga reaktywności typu cytotoksycznego, co powoduje odsłonięcie dotąd niedostępnych autoantygernów błon komórkowych, zwłaszcza glikolipidowych, które są rozpoznawane przez limfocyty NKT,

4) stymulacja komórek NKT prowadzi do syntezy wielu cytokin zarówno typu Th1 jak i Th2 i silnych reakcji cytotoksycznych, co uszkadza komórki endotelium (LSEC) i zaburza ich naturalną funkcję utrzymywania i limfocytów w stanie tolerancji na wiele antygenów, a także ułatwia dostęp cytotoksycznych limfocytów do hepatocytów, co ułatwia ich niszczenie,

5) zmiana mikrośrodowiska, (obecność aktywowanych komórek i cytokin) całkowicie zmienia warunki funkcjonowania komórek układu odpornościowego w wątrobie. Dochodzi do pogłębiajacych się zaburzeń tolerancji, głównie spowodowanych nieprawidłowymi warunkami prezentacji zarówno autoantygenów inicjujących proces autoagresji jak i nowo pojawiających się swoistości antygenowych w trakcie trwania procesu chorobowego (6).