Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2016, s. 12-19
*Weronika Wojnar, Ewa Kucharek, Ilona Kaczmarczyk-Sedlak
Analiza zawartości związków farmakologicznie czynnych w zielu seradeli siewnej (Ornithopus sativus Brot.)
Analysis of pharmacologically active compounds content in herb of seradella (Ornithopus sativus Brot.)
Katedra Farmakognozji i Fitochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Katedry: dr hab. n. farm. Ilona Kaczmarczyk-Sedlak
Summary
Ornithopus sativus Brot. (seradella or common bird’s foot) is an annual forage crop belonging to Fabaceae family. Other plants belonging to this family are commonly used as medicinal plants or as a source of pharmacologically active compounds such as coumarins, saponins, phenolic acids, alkaloids and flavonoids (especially isoflavonoids).
The aim of the presented study was to identify pharmacologically active compounds in the herb of common bird’s foot.
The grounded material (aerial parts of the plant) was extracted in various extrahents and then quantitative tests (for flavonoids, tannins and saponins) as well as 1D and 2D thin layer chromatography for flavonoids, phenolic acids, coumarins, trigonneline and arbutin were performed. In 1D and 2D TLC extracts were separated on Silica-gel plates 60 F254, visualized and then analyzed in UV light.
Obtained results indicated, that in analyzed herb, the tannins and flavonoids are present, while there was no sign of saponins. Among all detected substances, some flavonoids (quercetin, kaempferol, genistein, daidzein, glabridin, biochanin A, rhamnetin, luteolin, apigenin, formononetin and mirycetin), were found in seradela herb. Phenolic acids (caffeic acid, chlorogenic acid and ferulic acid) and coumarins (umbelliferone) were also identified in analyzed material. There was no sign of arbutin or alkaloid trigonneline in tested sample.
Wstęp
Opis botaniczny rośliny
Ornithopus sativus Brot. (seradela siewna, syn. francuska) to uprawna roślina pastewna należąca do rodziny Fabaceae (bobowate) (1). Jest rośliną rozgałęzioną o pokroju początkowo wyprostowanym, z czasem płożącą (2). Łodyga wznosi się na wysokość 30-90 cm (1). Pędy są smukłe, dobrze wykształcone, krótko owłosione, gęsto ulistnione. Seradela ma cienkie, wykopodobne, nieparzysto pierzastozłożone, siedzące liście o długości 3-7 cm, liczące od 19 do 35 szeroko umiejscowionych, mniejszych listków o długości 4-13 mm i szerokości 3-6 mm. Są one koloru niebieskawozielonego (2, 3). Kwiaty są szypułkowate, baldachopodobne o długości 5-8 mm, typowego kształtu, koloru od różowego do białego, ułożone w grupy od 2 do 7 (2). Seradela wytwarza nasiona w skórzastych (łykowatych) strąkach, które mogą być podzielone na pojedyncze segmenty. Strąki są spłaszczone, proste albo nieznacznie skręcone, długości 12-25 mm, wąskie między nasionami, zwężające się ku górze. Zawierają od 3 do 7 pojedynczych dojrzewających nasion. Strąki występują na wysokości do 70 cm. Seradela wykształca nasiona żółtojasnobrązowe, podłużnego kształtu, długości od 1,5 do 3 mm, w liczbie 350-450 000/kg. Odznacza się głębokim systemem korzeniowym, dzięki któremu zdolna jest do zachowywania wilgoci oraz składników odżywczych w glebie (4).
Historia i występowanie
Seradela występuje głównie na suchych, piaszczystych glebach Portugalii, zachodniej i centralnej części Europy, w Australii i południowo-wschodniej części USA. Jest powszechnie uprawianą rośliną paszową na Półwyspie Iberyjskim i niektórych obszarach północnej części Afryki. W niektórych rejonach używana jest jako uprawna roślina paszowa (zielona i sucha pasza) albo jako zielony nawóz. Często rośnie w posianym zbożu i stosowana jest w płodozmianach w celu wzbogacenia gleby w azot.
Historia uprawy seradeli sięga XVIII wieku. Początkowo uprawiana była w Portugalii, skąd w XIX wieku rozprzestrzeniła się na Europę Zachodnią i Środkową. Ostatnio powierzchnie upraw w niektórych częściach Europy uległy zmniejszeniu. Intensywny program upraw został ustanowiony w Australii w celu przeprowadzania krzyżówek (hybrydyzacji), które zostały zastosowane, aby zwiększyć postęp hodowli (5). Hodowcy upraw we Francji wprowadzili kilka odmian, które są szeroko stosowane i używane głównie przez Australijczyków (6). Zdarza się, że na terenach uprawnych roślina ta dziczeje (2).
Cel pracy
Wiele roślin z rodziny Fabaceae, ze względu na bogactwo metabolitów wtórnych, wykazujących działanie farmakologiczne, jest używanych w medycynie konwencjonalnej oraz ludowej. Spośród substancji aktywnych, występujących w surowcach należących do tej rodziny, można wyróżnić: śluzy, alkaloidy, kumaryny, saponiny steroidowe i triterpenowe oraz w dużej ilości flawonoidy. Związki biologicznie aktywne występują w różnych częściach roślin z rodziny bobowatych. Można je znaleźć zarówno w kwiatach (Trifolii flos), korzeniach (Glycyrrhizae radix), nasionach (Glycine semen, Cytisi semen), jak również zielu (Meliloti herba, Trifolii herba, Genistae herba).
Seradela siewna (Ornithopus sativus), należąca do rodziny Fabaceae, jest rośliną uprawną o zastosowaniu paszowym, dlatego można przypuszczać, że nie zawiera ona związków szkodliwych lub trujących dla organizmów zwierzęcych. Ze względu na fakt, że wiele roślin – przedstawicieli rodziny bobowatych jest stosowanych w lecznictwie, można sądzić, że seradela również może zawierać metabolity wtórne o znaczeniu farmakologicznym.
Celem niniejszej pracy było opracowanie i zoptymalizowanie procesów izolacji substancji aktywnych z ziela Ornithopus sativus, ze szczególnym uwzględnieniem związków flawonoidowych, zoptymalizowanie warunków rozdziału metodą TLC uzyskanych związków oraz wstępna ich identyfikacja.
Materiał i metody
Materiał roślinny
Do badań użyto ziela seradeli siewnej (Ornithopus sativus). Nasiona rośliny zakupione zostały w firmie Małopolska Hodowla Roślin HBP sp. z o.o., a następnie wysiane na terenie Ogrodu Botanicznego w Mikołowie. Wysiewu nasion dokonano z końcem kwietnia 2012 roku, a zbioru ziela w sierpniu tego samego roku. Zebrane ziele wysuszono w zaciemnionym, przewiewnym pomieszczeniu. Wysuszony materiał roślinny przechowywano w ciemnym miejscu w papierowych opakowaniach.
Do badań ziele wstępnie pocięto, a następnie drobno zmielono i przechowywano w ciemnych, szklanych zamykanych naczyniach.
Reakcje jakościowe
W celu zidentyfikowania wybranych grup związków farmakologicznie aktywnych w badanym materiale wykonano reakcje charakterystyczne.
Obecność flawonoidów została określona za pomocą reakcji:
– Shinody: do 1 ml ekstraktu metanolowego (1 mg/ml) dodano opiłków cynku i niewielką objętość stężonego kwasu solnego; pozytywny wynik to zmiana barwy roztworu charakterystyczna dla danej grupy flawonoidów: pomarańczowe zabarwienie roztworu świadczy o obecności flawonów, malinowoczerwone – flawonoli, a fioletowoczerwone – flawononów; brak zabarwienia jest charakterystyczny dla chalkonów i auronów,
– reakcji z kwasem borowym: 2 ml ekstraktu metanolowego 1 mg/ml odparowano do sucha w porcelanowej parownicy, następnie do parownicy dodawano kwasu bornego (3 ml) o stężeniu 3% oraz kwasu szczawiowego (roztwór 10%) i kolejny raz poddawano całkowitemu odparowaniu; suchą pozostałość zawieszono w 10 ml eteru dietylowego i obserwowano pod lampą UV – fluorescencja w ultrafiolecie świadczy o obecności związków flawonoidowych.
Saponiny identyfikowano za pomocą próby pienienia: odważono 0,5 g ziela seradeli siewnej i przeniesiono do kolby o pojemności 25 ml, następnie dodano 10 ml 1% wodnego roztworu taniny w celu strącenia substancji białkowych i przesączono przez sączek do probówki, której zawartość wytrząsano przez 2 minuty – utrzymywanie się piany na powierzchni roztworu przez 60 sekund świadczy o obecności saponin w surowcu.
W celu zbadania obecności garbników wykorzystano wyciąg przygotowany w 50% metanolu (0,05 g/ml) i wykonano:
– próbę osadową: do 1 ml wyciągu metanolowego dodawano stopniowo 0,5% wodny roztwór żelatyny – obecność osadu jest wynikiem pozytywnym,
– reakcję z chlorkiem żelaza: do 1 ml wyciągu dodano kilka kropli 5% AlCl3; granatowe zabarwienie świadczy o obecności garbników hydrolizujących,
– reakcję z odczynnikiem wanilinowym: do 1 ml wyciągu dodano 0,25 ml roztworu waniliny w kwasie solnym. W przypadku obecności garbników skondensowanych wyciąg zabarwia się na czerwono (7).
Ekstrakcja związków farmakologicznie aktywnych
W celu wyizolowania aglikonów flawonoidów, do 2 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 2 ml 2M kwasu solnego i 10 ml acetonitrylu. Całość wytrząsano 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie płyn przesączono przez sączek karbowany i całkowicie odparowano. Suchą pozostałość rozpuszczono w 10 ml metanolu 80% i ponownie odparowywano do objętości 2 ml (8).
Dodatkowo dokonano modyfikacji hydrolizy kwasowej glikozydów flawonoidowych:
– do 2 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 5 ml acetonitrylu oraz 2 ml 2 M kwasu solnego. Po dwugodzinnym wytrząsaniu i przesączeniu przez sączek karbowany ekstrakt odparowano do suchej pozostałości na szkiełku zegarkowym. Następnie dodano 5 ml metanolu 80% i zagęszczono do objętości 2 ml,
– do 2 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 10 ml acetonitrylu oraz 2 ml 2 M kwasu solnego. Całość wytrząsano przez 2 godz. i przesączono przez sączek karbowany. Ekstrakt odparowano do suchej masy na szkiełku zegarkowym. Następnie dodano 5 ml metanolu 80% i zagęszczono do objętości 1 ml,
– do 4 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 4 ml 2 M kwasu solnego oraz 20 ml acetonitrylu. Po dwugodzinnym wytrząsaniu wyciąg przesączono przez sączek karbowany na szkiełko zegarkowe i odparowywano na łaźni wodnej do suchej pozostałości. Następnie dodano 5 ml metanolu 80%.
Glikozydy flawonoidowe izolowano z surowca zgodnie z opisem zamieszczonym w Farmakopei Polskiej VI (9). Dokonano również ekstrakcji pozwalających na identyfikację arbutyny, trygoneliny i związków kumarynowych, zgodnie z procedurami opisanymi w piśmiennictwie (7, 10, 11).
Chromatografia cienkowarstwowa
Chromatografię cienkowarstwową wykonywano dwiema metodami – jedno- (1D TLC) i dwukierunkową (2D TLC).
W chromatografii jednokierunkowej zastosowano szereg układów rozwijających, wskazanych w publikacjach. Niektóre układy zmodyfikowano (tab. 1). W 2D TLC wykorzystano kombinacje faz ruchomych użytych w 1D TLC (tab. 2). Jako fazy stałej używano płytek pokrytych Silica Gel 60 F254 (Merck). Jako odczynnik wywołujący zastosowano Natural Products Reagent (Sigma).
Tab. 1. Wykaz zastosowanych układów rozwijających w 1D TLC
RozpuszczalnikiProporcjeŹródło literaturowe
Dichlorometan:izopropanol95:5 (v/v)(16)
Dichlorometan:izopropanol97,5:2,5 (v/v)(16)
Dichlorometan:izopropanol90:10 (v/v)(16)
Toluen:chloroform:aceton40:25:35 (v/v)(17)
Octan etylu:kwas octowy:kwas mrówkowy:woda100:11:11:27 (v/v)(9)
Chloroform:aceton:kwas mrówkowy75:16,5:8,5 (v/v)(18)
Toluen:octan etylu:kwas octowy14:6:1 (v/v)(11)
N-propanol:metanol:woda4:1:4 (v/v)(10)
Octan etylu:metanol:woda100:17:13 (v/v)(7)
Tab. 2. Wykaz zastosowanych układów rozwijających w 2D TLC
Kierunek 1Kierunek 2
Dichlorometan:izopropanol
(28,5:1,5 v/v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Dichlorometan:izopropanol
(25:5 v/v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Dichlorometan
(30 v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v)
Octan etylu:kwas octowy:kwas mrówkowy:woda
(100:11:11:27 v/v)
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v)
Chloroform:aceton:kwas mrówkowy
(75:16,5:8,5 v/v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Octan etylu:kwas octowy:kwas mrówkowy:woda
(100:11:11:27 v/v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Chloroform:aceton:kwas mrówkowy
(75:16,5:8,5 v/v)
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v)
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v)
Wyniki i dyskusja
Seradela siewna (Ornithopus sativus) jest rośliną powszechnie występującą w Europie, Australii oraz USA. Gatunek ten jest znany przede wszystkim jako roślina użytkowa i pastewna, lecz słabo zbadany pod kątem zawartości związków farmakologicznie aktywnych. Do tej pory w badaniach nad seradelą siewną skupiono się przede wszystkim na analizie zawartości związków steroidowych, takich jak brassinosteroidy (2). Seradela siewna należy do rodziny Fabaceae, do której zalicza się rośliny powszechnie stosowane w lecznictwie (m.in. soja, nostrzyk czy lukrecja). Surowce lecznicze pozyskiwane z roślin należących do tej rodziny bogate są w związki farmakologicznie aktywne, takie jak kumaryny i kwasy fenolowe, saponiny oraz wiele innych substancji stosowanych w medycynie. Rośliny lecznicze z rodziny Fabaceae zawierają również wiele związków flawonoidowych. Dlatego też celem pracy była identyfikacja związków farmakologicznie aktywnych w zielu Ornithopus sativus.
Aby zidentyfikować grupy tych związków w badanym materiale roślinnym, wykonano reakcje charakterystyczne, wskazujące na obecność lub brak badanych substancji. Lukrecja gładka (Glycyrrhiza glabra), roślina należąca do rodziny bobowatych, jest źródłem surowca leczniczego o zastosowaniu wykrztuśnym i ochronnym na śluzówkę żołądka. Swoje właściwości lecznicze zawdzięcza m.in. obecności saponin triterpenowych (12). Ze względu na fakt, że u niektórych przedstawicieli rodziny Fabaceae są obecne saponiny, postanowiono sprawdzić, czy seradela siewna, również należąca do tej rodziny, zawiera tego rodzaju związki. W tym celu wykonano próbę pienienia. Negatywny wynik tej próby, czyli brak utrzymującej się przez minutę piany na powierzchni wyciągu po 2-minutowym wytrząsaniu sugeruje, że w surowcu saponiny nie są obecne.
Na podstawie przeprowadzonych reakcji charakterystycznych stwierdzono obecność garbników w zielu Ornithopus sativus. Według danych piśmiennictwa, skondensowane garbniki zostały wykryte w wielu roślinach, w tym w roślinach bobowatych (13). Obecność garbników skondensowanych w roślinach bobowatych tłumaczy ich wykorzystanie jako pasz w rolnictwie, gdyż zapobiegają u przeżuwaczy wystąpieniu niestrawności i chronią białka pokarmowe przed drobnoustrojami. Izolowano je z Trifolium repens czy Trifolium arvense. Badania nad seradelą siewną przeprowadzone w niniejszej pracy dowiodły, że ziele tej rośliny zawiera związki o charakterze garbników pirogalolowych i pirokatechinowych.
Garbniki pirokatechinowe należą do grupy garbników skondensowanych, natomiast pirogalolowe są stosunkowo nietrwałe i łatwo hydrolizują, uwalniając kwas galusowy lub elagowy (14). Biologiczne i farmakologiczne działanie garbników uzależnione jest ściśle od ich struktury. Garbniki hydrolizujące składają się z kwasu galusowego lub elagowego oraz cząsteczki cukru. W organizmie ludzkim mogą zmniejszać dostępność żelaza i prowadzić do anemii. Garbniki skondensowane nie wchodzą w interakcje z żelazem i nadają się do konsumpcji i lecznictwa. Izolowano je z takich roślin, jak sosna zwyczajna (Pinus silvestris), jabłoń (Malus sp.), z czerwonego wina i cynamonu (Cinnamomum sp.). Garbniki skondensowane według badań wykazują szereg właściwości leczniczych. U pacjentów z defektem wydzielania mucyny przez komórki kubkowe zmniejszają stan zapalny w przewodzie pokarmowym podczas toczącego się wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, tworząc na powierzchni przewodu pokarmowego warstwę ochronną. Działają przeciwbakteryjnie wobec Staphylococcus aureus, a także wobec bakterii z gatunków Bacillus subtilis i Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej). Dzięki tym właściwościom pomagają utrzymać prawidłową florę bakteryjną przewodu pokarmowego (15).
Flawonoidy to powszechnie występujące związki w roślinach z rodziny Fabaceae. Ich obecności w zielu O. sativus dowiodły przeprowadzone reakcje jakościowe. Na podstawie koloru uzyskanego w reakcji Shinody stwierdzono flawonoidy w zielu badanej rośliny.

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2015-08-12
zaakceptowano do druku: 2015-09-23

Adres do korespondencji:
*mgr Weronika Wojnar
Katedra i Zakład Farmakognozji i Fitochemii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec
tel. +48 (32) 364-15-23
e-mail: wwojnar@sum.edu.pl

Postępy Fitoterapii 1/2016
Strona internetowa czasopisma Postępy Fitoterapii