Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 2/2009, s. 138-148
Piotr Brągoszewski, Jerzy Ostrowski*
Medycyna mitochondrialna
Mitochondrial medicine
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Klinika Gastroenterologii i Hepatologii w Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Warszawa
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. Jarosław Reguła
Streszczenie
Główną funkcją mitochondriów jest produkcja ATP, ale biorą one również udział w regulacji procesów termogenezy, produkcji wolnych rodników, homeostazy wapniowej czy apoptozy. Produkcja ATP, pochodząca z fosforylacji oksydacyjnej, jest niezbędna dla większości funkcji komórkowych i jest ściśle powiązana z zapotrzebowaniem organizmu na energię. Mitochondria komórek ssaczych są zbudowane z ~1000 białek, spośród których jedynie 13 jest kodowane w genomie mitochondrialnym. Inne białka mitochondrialne są kodowane w genomie jądrowym, syntetyzowane w cytoplazmie i importowane do mitochondriów.
Mechanizmy ochronne mitochondriów przed mutagenezą są zdecydowanie słabsze w porównaniu z podobnymi mechanizmami działającymi w odniesieniu do genomu jądrowego. Dodatkowo, wysokie tempo powstawania mutacji w obrębie mitochondrialnego DNA (mtDNA), wielokrotnie większe niż w jądrowym DNA, jest prawdopodobnie związane z reaktywnymi formami tlenu (ROS), produkowanymi przez mitochondrialny system fosforylacji oksydacyjnej. Zwiększoną akumulację somatycznych mutacji mtDNA opisywano w starzejących się tkankach oraz w wielu stanach chorobowych, jak schorzenia neurologiczne, metaboliczne i towarzyszące procesowi starzenia się. Są one zwłaszcza częste w stanach przednowotworowych oraz w rakach piersi, jajnika, jelita grubego, żołądka, wątroby, przełyku, gruczołu krokowego i tarczycy. W konsekwencji sugeruje się, iż mutacje mtDNA mogą służyć jako biomarkery chorób, w tym chorób nowotworowych, ale także jako czynniki predykcyjne przebiegu choroby.
Celem tego artykułu jest opis zaburzeń mitochondrialnych, towarzyszących różnym schorzeniom oraz metod analitycznych umożliwiających diagnostykę tych zaburzeń.
Summary
Mitochondria are most notably involved in ATP production but also contribute to thermogenesis, free radical production, calcium homeostasis, and apoptosis. ATP production is required for most cellular functions, and cellular energy requirements are largely met by the mitochondrial oxidative phosphorylation system. Mammalian mitochondria contain ~1000 proteins but only 13 of them are encoded by the mitochondrial genome. Other mitochondrial proteins are encoded by nuclear DNA, synthesized in the cytoplasm, and imported by the mitochondria.
Mitochondrial protective effects against mutagenesis are much less strong than those in the nuclear genome. In addition, the high rate of mitochondrial DNA (mtDNA) mutation, which is several times higher than the rate for nuclear DNA, is likely explained by the production of reactive oxygen species by the mitochondrial oxidative phosphorylation system. Increased accumulation of mtDNA somatic mutations has been reported in aging tissues and in many pathological conditions including neurologic, metabolic, and age-related disorders. These alterations are especially prevalent in preneoplastic lesions and in human cancers, including breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, hepatic cancer, esophageal cancer, prostate cancer, and thyroid cancer. Thus, many studies have proposed that mtDNA mutations might serve as both disorder biomarkers, including carcinogenesis, and as predictive factors for the disease course.
This article intends to review mitochondrial dysfunctions associated with different types of disorders as well as molecular methods applicable for diagnosis of these alterations.
Mitochondria
Mitochondria są organellami komórkowymi, obecnymi we wszystkich organizmach eukariotycznych. Dzięki nim zachodzi proces oddychania tlenowego, dostarczający energii pod postacią ATP i ciepła. Funkcje mitochondriów są jednak znacznie szersze i dotyczą między innymi procesów metabolizmu lipidów, aminokwasów, węglowodorów i nukleotydów, homeostazy jonowej, aktywnego transportu oraz ruchu komórek. Poprzez udział w wewnątrzkomórkowej sygnalizacji apoptozy, mitochondria odgrywają także znaczącą rolę w zachowaniu równowagi pomiędzy procesami podziałów i śmierci komórek.
Chociaż mitochondria są tradycyjnie postrzegane jako małe, samodzielne organelle, to w rzeczywistości tworzą złożone struktury dzięki zdolności przemieszczania się, łączenia i rozdzielania (1). Ich ilość w komórce jest związana z zapotrzebowaniem danej tkanki na energię, pochodzącą z fosforylacji oksydacyjnej. Dlatego też neurony, komórki mięśni szkieletowych, czy mięśnia sercowego zawierają większą liczbę mitochondriów niż komórki innych tkanek, co do pewnego stopnia wyjaśnia również zwiększoną wrażliwość tych komórek na wszelkie defekty mitochondrialne (2).
Za przemiany energetyczne odpowiada w mitochondriach pięć kompleksów białkowych, składających się na łańcuch oddechowy. Pierwsze cztery, uczestniczące w transporcie elektronów, to w kolejności działania: kompleks I, czyli reduktaza dinukleotydu nikotynoadeninowego-koenzym Q (NADH-CoQ), kompleks II, czyli reduktaza bursztynian-CoQ, kompleks III, czyli kompleks cytochromów bc 1, kompleks IV, czyli oksydaza cytochromu c (3). Przemiany zachodzące w tych czterech kompleksach pozwalają na wytworzenie różnicy potencjałów ΔP w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Różnica potencjałów umożliwia syntezę ATP, kiedy protony wracają do macierzy mitochondrialnej za pośrednictwem kompleksu V – syntazy ATP. Stosunek wartości ΔP do ilości powstającego ATP świadczy o wydajności tego procesu. Jeżeli łańcuch oddechowy bez strat transportuje protony na zewnątrz macierzy, a każdy proton wraca za pośrednictwem kompleksu V, to ilość energii rozpraszanej w postaci ciepła jest minimalizowana, a pozostała część energii zostaje zmagazynowana pod postacią ATP. W przypadku, gdy możliwy jest transport protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną z pominięciem syntazy ATP, równowaga zostaje przesunięta w kierunku produkcji ciepła. Odpowiednie sterowanie tymi procesami decyduje, ile ze zużytych kalorii posłuży do utrzymania temperatury organizmu, a ile do wytworzenia ATP.
Przemianom energetycznym w mitochondriach towarzyszy powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS ang. reactive oxygen species), które choć potencjalnie szkodliwe, są także wykorzystywane w szlakach przekazywania sygnału (4, 5) i niektórych biogenezach, jak np. w syntezie prostaglandyn. Wszelkie zaburzenia transportu elektronów w łańcuchu oddechowym, prowadzące do wzmożonego wytwarzania ROS lub osłabienie mechanizmów ich usuwania, stwarzają warunki stresu oksydacyjnego groźne dla komórki. Stres oksydacyjny może uruchamiać szlak apoptozy, prowadząc do śmierci komórki (6, 7, 8). Za neutralizację ROS odpowiada między innymi dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza oraz peroksydazy (9). Procesy wytwarzania i usuwania ROS muszą znajdować się w stanie równowagi, aby zapewnić komórce optymalny ich poziom.
Genom mitochondrialny
Mitochondria posiadają własny genom, co wiąże się bezpośrednio z ich endosymbiotycznym pochodzeniem. W toku ewolucji mitochondrialny DNA (mtDNA) stracił swoją niezależność i funkcjonuje pod kontrolą genomu jądrowego, nadal jednak wykazuje pewien stopień autonomii genetycznej, co pozostaje istotnym czynnikiem w funkcjonowaniu mitochondriów (10). W normalnym stanie ludzkie mtDNA jest dwuniciową, kolistą, superzwiniętą cząsteczką o długości 16,6 tysiąca par zasad. Mitochondrialny DNA nie jest powiązany z histonami, a wiążące się z nim białka organizują mitochondrialne genomy w nukleoidy, zawierające kilka cząsteczek mtDNA (11). Na jedno mitochondrium przypada od 2 do 10 kopii genomu, a komórki zawierają najczęściej od 100 do 2000 mitochondriów. Konsekwencją tak dużej multiplikacji jest stosunkowo duża zawartość mtDNA w komórce.
Obie nici ludzkiego mtDNA zawierają łącznie 37 genów kodujących – 13 polipeptydów wchodzących w skład kompleksów białkowych łańcucha oddechowego, dwa rybosomalne RNA (rRNA) oraz 22 cząsteczki tRNA (12). Pozostałe białka, odpowiedzialne za funkcje i strukturę mitochondriów, tworzą łącznie grupę około tysiąca białek mitochondrialnych i są kodowane w genomie jądrowym. Podlegają one translokacji do mitochondriów, a selektywny import oraz ich ostateczna lokalizacja w jednym z subkompartmentów mitochondrialnych: zewnętrznej błonie mitochondrialnej, przestrzeni międzybłonowej, błonie wewnętrznej, lub macierzy, zależy od obecności odpowiedniej sekwencji lokalizacji mitochondrialnej w tych białkach, lub od tworzenia kompleksów z białkami opiekuńczymi (13). Funkcjonowanie mitochondriów znajduje się zatem pod kontrolą dwóch genomów – genomu jądrowego, kodującego większość genów oraz małego genomu mitochondrialnego, niezbędnego dla procesów oddechowych. Mutacje w każdym z nich mogą być przyczyną zaburzenia funkcjonowania mitochondriów.
Kodowane przez mtDNA geny nie zawierają intronów i znajdują się blisko siebie, pozostawiając niewiele sekwencji niekodujących. Jedynym dużym niekodującym fragmentem jest region kontrolny, liczący około 1100 par zasad. Ze względu na to, że w regionie tym formowana jest struktura pętli D, związana z replikacją mtDNA, cały niekodujący fragment nazywany jest regionem pętli D. W chwili obecnej znana jest funkcja tylko niewielkiej części tej sekwencji. Z pewnością bierze ona udział w replikacji genomu mitochondrialnego, ale dokładny przebieg tego procesu budzi wątpliwości (14, 15). Zawiera również sekwencje odpowiedzialne za inicjację transkrypcji kodowanych genów (16). Choć molekularny model mitochondrialnej transkrypcji został stosunkowo dobrze opisany, to mechanizm regulacji tego procesu pozostaje właściwie nieznany (17, 18).
Genetyka mitochondrialna
Genom mitochondrialny odznacza się wyższą zmiennością w stosunku do genomu jądrowego. Brak ochronnego działania histonów, mniej wydajne systemy naprawy oraz bliskość łańcucha oddechowego, będącego głównym źródłem ROS w komórce, sprawia, że częstość mutacji mtDNA jest ponad 10-krotnie wyższa w porównaniu do DNA jądrowego (nDNA) (19). Najczęściej występującymi zmianami są podstawienia pojedynczych zasad, powstające zapewne w następstwie ekspozycji mtDNA na uszkadzające działanie ROS (20, 21). Wysoka gęstość kodowanej informacji, wynikająca z braku intronów powoduje, że wiele mutacji w regionie kodującym prowadzi do wystąpienia zaburzeń mitochondrialnych, zmieniając sekwencje podjednostek łańcucha oddechowego, rRNA lub tRNA. Z kolei mutacje zlokalizowane w niekodującym regionie pętli D mogą wpływać na replikację i transkrypcję genomu mitochondrialnego (22). Brak dostatecznej wiedzy sprawia jednak, że często trudno jest przewidzieć efekt biologiczny mutacji w tym regionie.
Właściwości mtDNA oraz sposób jego dziedziczenia tworzą reguły genetyki mitochondrialnej:
1. Dziedziczenie mateczne. Wzór przekazywania mtDNA jest całkowicie różny od zasad dziedziczenia mendlowskiego. W czasie zapłodnienia całość mtDNA pochodzi od oocytu, a więc dziedziczone jest po matce i nie podlega rekombinacji. Chociaż istnieją w literaturze pojedyncze opisy wyjątków od tej reguły (23), to nie można wykluczyć, że są rezultatem błędów w pracy laboratoryjnej (24).
2. Heteroplazmia i wartość progowa. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, który w komórce spoczynkowej występuje w jednej kopii, każda komórka zawiera od setek do tysięcy kopii mtDNA. Stan, w którym wszystkie kopie mtDNA są identyczne, określa się mianem homoplazmii. Gdy dochodzi do mutacji, zmiana nie dotyczy wszystkich cząsteczek mtDNA obecnych w komórce, prowadząc do stanu heteroplazmii. Jeżeli zmiana w sekwencji ma charakter chorobotwórczy, to ekspresja fenotypowa mająca znaczenie kliniczne jest uzależniona w dużej mierze od ilościowego stosunku mtDNA prawidłowego do zmutowanego. Można więc mówić o wartości progowej tego stosunku, po przekroczeniu której mutacja ujawnia się fenotypowo. Wartość ta jest różna w zależności od rodzaju mutacji, typu tkanki i jej potrzeb związanych z metabolizmem tlenowym (2).
3. Segregacja mitotyczna. Jeżeli w komórce współistnieją mitochondria posiadające prawidłowe i zmutowane mtDNA, to w czasie podziału mitotycznego są one losowo przekazywane do komórek potomnych, a zatem ich wzajemne proporcje mogą ulegać zmianom, prowadząc również do zmian fenotypu komórkowego. Ten fenomen, zwany segregacją mitotyczną, wyjaśnia między innymi w jaki sposób u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi wraz z wiekiem chorego może zmienić się rodzaj i nasilenie objawów klinicznych (2).
Haplogrupy mitochondrialne
Specyfika dziedziczenia oraz częstość występowania mutacji sprawiły, że analiza mtDNA jest intensywnie wykorzystywana w badaniach filogenetycznych, dotyczących pochodzenia współczesnego człowieka. Możliwe jest prześledzenie „drogi” mtDNA od początków ludzkości przez identyfikacje polimorfizmów sekwencji mtDNA, które akumulowały się z biegiem lat. Zestawy takich polimorfizmów definiują grupy mtDNA, które wyewoluowały od wspólnego przodka – są to haplogrupy mitochondrialne. Obecnie haplogrupy oznaczane są za pomocą wielkich liter wraz z numerami określającymi podgrupy. Według aktualnych klasyfikacji, drzewo ludzkiego mtDNA ukorzenione jest w Afryce, 140 do 180 tysięcy lat temu i daje początek siedmiu głównym grupom nazwanym: L0, L1, L2, L3, L4, L5 i L6. Wszystkie pozaafrykańskie mtDNA pochodzą od haplogrupy L3, rozdzielając się na dwie klasy M i N. W przypadku Europy dominuje osiem haplogrup (H, U, K, J, T, V, X, I, W), wywodzących się z klasy N (25, 26).
Szybki rozwój tej dziedziny wiedzy staje się fundamentem dla nowej gałęzi badań, poszukujących związku między przynależnością do mitochondrialnych haplogrup a fenotypem. Przesłanką do tych badań był fakt, że dystrybucja poszczególnych haplogrup, jest silnie specyficzna dla regionu (26), prowadząc do hipotezy, że akumulacja zmian w sekwencji mtDNA mogła wpływać na produkcję ciepła przez mitochondria, a tym samym mogła być czynnikiem korzystnym w adaptacji do różnych warunków klimatycznych (27, 28). Zmiany sekwencji można podzielić na trzy kategorie:
a) obojętne,
b) szkodliwe,
c) adaptacyjne (pozytywne).
Część mutacji mtDNA, które nastąpiły w czasie wyodrębniania się haplogrup doprowadziło do zmiany kodowanych aminokwasów, a ponieważ zostały zachowane, prawdopodobnie dawały adaptacyjną przewagę. Zakłada się, że prowadząc do częściowego rozprzęgania łańcucha oddechowego, zwiększały produkcję ciepła, co ułatwiało przetrwanie w zimnym klimacie (29).
Choroby mitochondrialne
Ze względu na udział w kluczowych dla komórki procesach nie dziwi fakt, że choroba może być związana z zaburzeniem funkcjonowania mitochondriów. Większość chorób, w tym także te związane z mitochondriami, jest uwarunkowana genetycznie i może być zaliczona do jednej z trzech klas: chorób chromosomalnych, chorób jednogenowych lub chorób złożonych – wieloczynnikowych (30). Dwie pierwsze klasy, czyli zaburzenia skutkujące nieprawidłowościami w skali całego genomu oraz choroby wywoływane uszkodzeniem pojedynczego genu, charakteryzują się zwykle wysokim stopniem penetracji i wyraźną manifestacją fenotypu chorobowego, stanowiąc czynnik wysokiego ryzyka rozwoju choroby. Zaburzenia tego typu występują jednak względnie rzadko. Większość chorób ma charakter wieloczynnikowy, będąc wypadkową wielu efektów genetycznych o niskiej jednostkowej penetracji oraz wpływu środowiska (31). W przypadku chorób złożonych nie można mówić o genach odpowiedzialnych za rozwój choroby, a czynniki genetyczne należy traktować jako modyfikatory ryzyka.
Termin „choroba mitochondrialna” stosowany jest w odniesieniu do dysfunkcji łańcucha oddechowego i został wyodrębniony w patologii człowieka na przełomie lat 60- i 70-tych XX wieku (32). Pierwszy w pełni opisany przypadek pochodzi z roku 1962, gdy u chorej z zaburzeniami metabolizmu w testach biochemicznych potwierdzono bezpośredni udział mitochondriów w tych zaburzeniach, a badania mikroskopowe wykazały nieprawidłowości w budowie komórek mięśniowych, oraz zmiany strukturalne mitochondriów (33). Choć ówczesny poziom zaawansowania nauki nie pozwalał na wykrycie podłoża molekularnego tych zaburzeń, przypadek ten zwrócił uwagę na fakt, że dysfunkcje mitochondriów mogą być bezpośrednią przyczyną chorób u ludzi.
Ponieważ w skład kompleksów łańcucha oddechowego wchodzą podjednostki kodowane przez genom jądrowy i mitochondrialny, a dodatkowo jądrowy DNA koduje białka kontrolujące ekspresję i replikację mtDNA, choroby mitochondrialne mogą wynikać z mutacji DNA mitochondrialnego oraz, częściej, jądrowego. Znaczną część stanowią także choroby mitochondrialne, przebiegające z obniżeniem ilości mtDNA w stosunku do nDNA – zwane zespołami deplecji mtDNA – wywołane zaburzeniami syntezy nukleotydów, czy zaburzeniami komunikacji międzygenomowej (34). Gdy w 1988 roku po raz pierwszy wyjaśniono podłoże molekularne dysfunkcji mitochondrialnej, zaczęto wiązać poszczególne mutacje z wyodrębnionymi i opisanymi wcześniej zespołami chorobowych objawów. Okazało się jednak, że ta sama mutacja może wywoływać różne zespoły objawów, a fenotyp chorobowy jest często zależny od ilościowego stosunku mtDNA prawidłowego i niosącego mutacje w poszczególnych tkankach (35). Większość patogennych mutacji mtDNA występuje w stanie heteroplazmii; takie mutacje homoplazmatyczne byłyby letalne (36). Charakterystyczną cechą chorób mitochondrialnych, spowodowanych mutacjami w mtDNA, jest nasilanie się lub wręcz pojawianie się nowych objawów wraz z wiekiem chorego, co może być spowodowane postępującym stopniem uszkodzeń mtDNA związanym z oddziaływaniem ROS (29).
Objawy chorób mitochondrialnych są bardzo zróżnicowane i obejmują postępujące zmiany w mózgu, mięśniach, gruczołach wydzielania wewnętrznego, narządach zmysłu (głuchota, oftalmoplegia), a heterogenne, wielosystemowe objawy kliniczne utrudniają ich nazewnictwo (35). Do chorób mitochondrialnych, w których stwierdzono bezpośredni związek dysfunkcji mitochondriów z mutacjami DNA można zaliczyć następujące zespoły: Zespół MELAS czyli miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mleczanowa oraz występowanie incydentów podobnych do udarów (ang. mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes); Zespół MERRF czyli padaczka miokloniczna z występowaniem „włókien szmatowatych” w mięśniach, (ang. myoclonic epilepsy and ragged red fibres); Zespół CPEO czyli przewlekła postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (ang. chronic progressive external ophtalmoplegia); Zespół LHON czyli dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera (ang. Leber´s hereditary optic neuropaty); Zespół NARP czyli neurogenna miopatia z ataksją i zwyrodnieniem barwnikowym siatkówki (ang. neurogenic myopathy, ataxia, retinitis pigmentosa); Zespół KSS (ang. Kearns-Sayre syndrome), oraz Zespół szpikowo-trzustkowy Pearsona (2).
Powyższe choroby występują rzadko, brak jednak dokładnych danych o ich częstości w populacji. Metaanaliza przeprowadzona przez DiMauro (37) wskazuje jednak, że sumarycznie zaburzenia te mogą występować z częstością raz na 5000 osób.
Mitochondria a choroby wieloczynnikowe
Opisane powyżej choroby mitochondrialne należy zaliczyć do zaburzeń jednogenowych lub chromosomalnych. Coraz częściej uzyskujemy także dowody na związek zaburzeń mitochondrialnych z występowaniem chorób wieloczynnikowych. Zalicza się do nich choroby nowotworowe, choroby metaboliczne (jak cukrzyca) oraz choroby degeneracyjne układu krążenia i układu nerwowego. Cechą wspólną tych chorób jest powiązanie z procesem starzenia, a ich późne występowanie i postępujący przebieg może być wynikiem akumulacji mutacji mtDNA. Ponadto wiele z chorób powiązanych z wiekiem wykazuje różne nasilenie w zależności od regionu, co może odpowiadać regionalnej dystrybucji mitochondrialnych haplogrup (29, 38). „Medycynę mitochondrialną” można zatem podzielić na dwa działy. Pierwszy koncentruje się na identyfikacji patogenicznych mutacji, które w sposób bezpośredni odpowiadają za występowanie dysfunkcji łańcucha oddechowego i związanej z tym choroby. Drugi wynika z założenia, że zmiany w mtDNA mogą być czynnikami ryzyka w powstawaniu choroby wieloczynnikowej. Może również zaistnieć taka sytuacja, w której choroba nie wynika z uszkodzenia mitochondriów, ale jej rozwój prowadzi do takich zmian w funkcjonowaniu mitochondriów, że stają się one markerem choroby.
Choroby nowotworowe
Stosunkowo najwięcej uwagi poświęca się udziałowi dysfunkcji mitochondriów w chorobach nowotworowych. Już ponad 70 lat temu na możliwość powiązania zaburzeń mitochondrialnych z chorobami nowotworowymi zwrócił uwagę badacz procesów oddechowych, niemiecki biochemik Otto Warburg. W swoich pracach wykazał, że w komórkach nowotworowych metabolizm ulega przesunięciu z procesu oddychania w kierunku glikolizy – komórki nowotworowe aktywnie metabolizują glukozę do kwasu mlekowego nie wykorzystując tlenu, mimo jego obecności. To nietypowe zachowanie komórek nowotworowych, nazwane glikolizą tlenową, stało się podstawą hipotezy Warburga, wskazującej na kluczową rolę „uszkodzenia” oddychania komórkowego w procesie nowotworzenia. Wszelkie defekty łańcucha oddechowego mogą wiązać się z tworzeniem wolnych rodników (39), co potwierdza stale rosnąca liczba publikacji wskazujących na wzmożoną produkcję wolnych rodników i nasilenie związanego z tym stresu oksydacyjnego w komórkach nowotworowych (40).
Kolejne obserwacje wykazały między innymi, że liczba mitochondriów oraz aktywność enzymów łańcucha oddechowego w wielu nowotworach są obniżone, natomiast ilość mRNA niektórych genów kodowanych przez mtDNA może ulegać zwiększeniu (41). Duże znaczenie miały tutaj wyniki badań wskazujące na powiązanie anomalii długości mtDNA z progresją przewlekłej białaczki limfatycznej. Obserwacja ta dała początek hipotezie o zaangażowaniu uszkodzeń mitochondrialnego genomu w procesie nowotworzenia. Sugerowano również, że uszkodzenia mtDNA mogą być jedną z przyczyn deregulacji bioenergetyki komórki nowotworowej, prowadzącej do zmian zgodnych z hipotezą Warburga.
Badania ostatnich lat opisują częste występowanie mutacji mtDNA m.in. w rakach piersi (42, 43, 44, 45), gruczołu krokowego (46, 47), jelita grubego (48, 49), żołądka (50, 51), przełyku (52, 53), wątroby (54), jajnika (55), tarczycy (56, 57) i w białaczkach (58, 59). Mutacje te dotykają zarówno sekwencji kodujących, jak i regionu kontrolnego i wydają się być zjawiskiem równie częstym, niezależnie od lokalizacji zmiany pierwotnej. Nie udało się jednak ustalić powiązań przyczynowo-skutkowych i dlatego nie mamy jeszcze odpowiedzi na ważne pytanie: czy obserwowane nieprawidłowości mitochondrialne są skutkiem rozwoju nowotworu, czy też są zmianami towarzyszącymi procesowi transformacji nowotworowej? Część prac wskazuje na korelację akumulacji mutacji mtDNA ze stopniem agresywności nowotworu i opornością na stosowane leczenie (43, 58), co może mieć znaczenie kliniczne.
Mutacje somatyczne mtDNA obserwowano również w przypadku zmian dysplastycznych, uznawanych za stany przedrakowe (49, 60, 61). Autorzy tych prac przedstawiają jednak rozbieżne opinie co do wartości prognostycznej badania tych mutacji.
Stosunkowo niedawno opublikowano pierwsze prace, wiążące mitochondrialne haplogrupy z ryzykiem rozwoju chorób nowotworowych. Wyniki analiz retrospektywnych, uzupełnione badaniami klinicznymi, wskazują na powiązanie europejskich haplogrup wywodzących się z haplogrupy N z wyższym ryzykiem raka piersi. Charakterystyczny dla tej grupy polimorfizm G10398A nie tylko może być markerem zwiększonego ryzyka, ale jego obecność może mieć również znaczenie w powstawaniu choroby, ponieważ w haplogrupach wywodzących się z N (62), w których nastąpiła wsteczna zmiana, przywracająca nukleotyd guanidynowy w pozycji 10398 (J1,J2,N1a,K1,B5,Y1,R11), ryzyko raka piersi jest niższe w porównaniu do pozostałych haplogrup wywodzących się z N . W ramach tych samych badań został wykazany podobny związek polimorfizmu G10398A z rakiem płaskonabłonkowym przełyku.
W innych badaniach wykazano, że dziedziczenie mitochondrialnej haplogrupy U jest związane z około dwukrotnym wzrostem ryzyka wystąpienia raka gruczołu krokowego i 2,5-krotnym wzrostem ryzyka raka nerki u białych mieszkańców Ameryki Północnej (63).
Przytoczone przykłady wskazują, że nie tylko mutacje, ale również polimorfizmy sekwencji mtDNA, gromadzone w trakcie ewolucji człowieka, mogą być powiązane z procesem powstawania nowotworu. Jednakże różnorodność obserwowanych zmian, a niejednokrotnie także sprzeczne wyniki badań sprawiają, że opinie na temat klinicznego znaczenia mutacji mtDNA w raku są zadziwiająco rozbieżne – od całkowitej niewiary (64), poprzez uznanie przydatności klinicznej części wyników badań mitochondrialnych (65), do optymistycznego założenia, że badania mitochondrialne u chorych z rakiem mogą być wykorzystane do poszukiwania wiarygodnych i skutecznych molekularnych markerów choroby (66).
Cukrzyca
Cukrzyca obejmuje grupę chorób metabolicznych charakteryzujących się hiperglikemią, które prowadzą do nieprawidłowości w funkcjonowaniu, uszkodzenia i ostatecznie niewydolności wielu narządów. Do podstawowych podtypów choroby zaliczamy zaburzenia wynikające tak z bezwzględnego (cukrzyca typu 1), jak i względnego niedoboru insuliny, wtórnego do obwodowej insulinooporności (cukrzyca typu 2) oraz cukrzyce innego typu, w tym uwarunkowane genetycznie zaburzenia kaskad sygnałowych, powiązanych z receptorem insulinowym.
Bez wątpienia cukrzyca typu 2 jest chorobą uwarunkowaną genetycznie oraz czynnikami środowiskowymi, zwiększającymi masę ciała w następstwie hiperalimenetacji. Jak wykazały badania epidemiologiczne u Indian Pima, posiadających fenotyp oszczędzający gospodarkę energetyczną, zmiana nawyków żywieniowych, powiązana ze znacznie mniejszym wydatkiem energetycznym potrzebnym do zdobywania pokarmu (poprzez przyznanie stałych racji żywnościowych), stała się powodem wzrostu występowania cukrzycy w tej społeczności. Podobne obserwacje dotyczą całego zespołu metabolicznego.
Natura uwarunkowań genetycznych cukrzycy typu 2 nie jest dokładnie poznana, chociaż można przypuszczać, że należą do nich zmiany modulujące insulinooporność, tak bezpośrednio jak i pośrednio, poprzez nadmierną masę tkanki tłuszczowej i specyficzny metabolizm organizmu. Z obserwacji pochodzących z genetyki klasycznej i analiz rodowodowo-klinicznych pacjentów chorujących na cukrzycę typu 2 wynika, że choroba ta, podobnie zresztą jak inne choroby złożone, jest uwarunkowana wielogenowo. Niezależnie od pierwotnej przyczyny cukrzycy, następstwem choroby jest przewlekła hiperglikemia. O prawidłowej homeostazie glukozy decyduje szereg narządów, w tym mięśnie szkieletowe i wątroba, których odpowiedź na działanie insuliny wytwarzanej przez wyspy trzustkowe jest modulowana przez cytokiny, wydzielane przez komórki tkanki tłuszczowej.
Centralną rolę w patogenezie cukrzycy typu 2 odgrywa niedostateczna odpowiedź metaboliczna komórek na aktywację receptora insulinowego tkanek obwodowych, czyli insulinooporność. Temu wczesnemu zaburzeniu metabolicznemu towarzyszy początkowo wzrost wydzielania insuliny przez komórki B wysp Langerhansa trzustki, który z czasem staje się niewystarczający do zwiększającego się na nią zapotrzebowania.
Odpowiedź wydzielnicza komórki B na stymulację glukozą wymaga zwiększenia mitochondrialnej produkcji ATP. Dochodzi do wzrostu stosunku ATP do ADP, co zapoczątkowuje następujący szereg zdarzeń: zamknięcie zależnych od ATP kanałów potasowych => depolaryzacja błony komórki B => otwarcie kanałów wapniowych => napływ jonów wapnia do wnętrza komórki => synteza i wydzielenie insuliny. Zatem, mitochondria są kluczowe w regulacji wydzielania insuliny, a ich dysfunkcja w komórkach B (podobna do dysfunkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych) może być jednym z patogenetycznych mechanizmów powstawania cukrzycy typu 2. Dysfunkcja mitochondriów może wynikać ze zwiększonej ekspozycji komórek na działanie glukozy (mechanizm glukotoksyczności) i/lub lipidy (mechanizm lipotoksyczności). Pozbawione mitochondriów komórki B nie mają zdolności wydzielania insuliny w odpowiedzi na bodziec sekrecyjny glukozy, zachowując tę zdolność w odpowiedzi na depolaryzację błony komórkowej. Cukrzyca „mitochondrialna” jest schorzeniem związanym z dysfunkcją komórek B, wynikłą z mutacji mitochondrialnego DNA.
Związki cukrzycy typu 2 z otyłością wynikają z obserwowanej w otyłości nadprodukcji wolnych kwasów tłuszczowych. Bezpośrednią przyczyną insulinooporności może być hamowanie przez kwasy tłuszczowe zależnych od działania insuliny transporterów glukozy, któremu towarzyszy zwiększony poziom trójglicerydów w wątrobie i mięśniach szkieletowych, zmniejszona mitochondrialna aktywność oksydacyjna kwasów tłuszczowych oraz obniżona produkcja ATP. Te zaburzenia mogą z kolei wynikać ze zmniejszenia liczby mitochondriów w komórkach mięśni szkieletowych i hepatocytach i/lub z dysfunkcji mitochondrialnych, skutkujących obniżoną aktywnością enzymów kompleksów łańcucha oddechowego.
W cukrzycy typu 2 komórki mięśni szkieletowych wykazują zaburzenia przemian energetycznych(67). Obserwuje się również obniżony poziom ekspresji genów mitochondrialnych. A ponieważ mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie glukozy i w produkcji ATP, można spodziewać się, że zmiany w mtDNA oraz mutacje genów mitochondrialnych kodowanych jądrowo, mogą mieć związek z rozwojem cukrzycy i jej powikłań. Przewlekły stres oksydacyjny może prowadzić do uszkodzeń siatkówki, nabłonka naczyń, nerwów obwodowych i nefronów. Na potencjalne znaczenie mtDNA może dodatkowo wskazywać niewielka przewaga dziedziczenia po matce (68). Ilustrację tego zjawiska stanowi mutacja w genie mt-tRNA dla leucyny w pozycji 3243, odpowiadająca również za część przypadków zespołu MELAS, która może w zależności od stopnia heteroplazmii wywoływać dziedziczoną matecznie cukrzycę typu 2. Mutacja ta odpowiada w przybliżeniu za 1% wszystkich przypadków cukrzycy (68). Wszystkie inne znane mutacje powiązane z występowaniem cukrzycy również mają związek z nieprawidłowościami mitochondrialnej bioenergetyki (29).
Prowadzono również badania poszukujące związku ryzyka zachorowania na cukrzycę typu 2 z przynależnością do haplogrupy mitochondrialnej, znajdując jak dotąd tylko słabą asocjację z haplogrupą J (69). Natomiast markerem ryzyka może być często występujący polimorfizm T16189C (69, 70) oraz inne polimorfizmy sekwencji mtDNA (71). Niezbyt silny efekt poszczególnych wariantów sprawia jednak, że przy małych grupach badanych jest on trudny do wyodrębnienia (38).
Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby
Inną z konsekwencji otyłości jest akumulacja lipidów w wątrobie, głównie pod postacią trójglicerydów, prowadząca do niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD, ang. nonalcoholic fatty liver disease). Uważa się, że problem ten może dotyczyć ponad 70% osób otyłych, przy czym dotyka również osoby młode, występując u 55% otyłych dzieci (72). Choroba stłuszczeniowa wątroby przebiega w większości przypadków bezobjawowo, nie prowadząc do zaburzenia czynności wątroby, może jednak dochodzić w jej przebiegu do progresji zmian morfologicznych wątroby o typie przewlekłego zapalenia z martwicą i towarzyszącym zwłóknieniem. Ten etap zmian, nazywany niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby (NASH, ang. nonalcoholic steatohepatitis) jest obserwowany u 30% osób z objawami insulinooporności oraz podwyższonym stężeniem trójglicerydów i cholesterolu (73). Dalsza progresja zaburzeń morfologicznych może prowadzić do marskości wątroby, a nawet pierwotnego raka wątroby (74).
W etiopatogenezie NAFLD i NASH od lat sugerowane są dysfunkcje mitochondrialne (74, 75, 76, 77, 78, 79). U pacjentów z NASH obserwuje się szereg nieprawidłowości związanych z funkcjonowaniem mitochondriów, łącznie ze zmianami strukturalnymi, prowadzącymi do powstania w hepatocytach megamitochondriów o nieprawidłowej budowie wewnętrznej błony mitochondrialnej (75, 76). W hepatocytach chorych na NAFLD produkcja ROS ulega nasileniu. Z jednej strony może na to wpływać zwiększona podaż elektronów, związana z nadmiarem metabolizowanych w mitochondriach kwasów tłuszczowych (80), z drugiej zaś samo upośledzenie funkcjonowania łańcucha oddechowego mitochondriów (81). Z kolei, wolne rodniki mogą bezpośrednio uszkadzać kompleksy białkowe łańcucha oddechowego oraz powodować uszkodzenia mitochondrialnego DNA, zmniejszając ekspresję genów mitochondrialnych. Reakcje wolnorodnikowe są również odpowiedzialne za procesy peroksydacji komórkowych lipidów (78), czego następstwem będą dalsze zaburzenia czynności łańcucha oddechowego, między innymi poprzez inaktywację oksydazy cytochromu c. Wszystkie te procesy prowadzą do dalszego zmniejszenia wydajności łańcucha oddechowego, tworząc swoiste „zamknięte koło” niekorzystnych metabolicznych przemian. U chorych z zespołem NASH stwierdzono zaburzenia homeostazy ATP (79) oraz obniżoną aktywność enzymatyczną wszystkich pięciu kompleksów łańcucha oddechowego (84). Kolejnym potwierdzeniem zaangażowania mitochondriów w rozwoju niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby są mutacje mtDNA w wątrobie opisane u chorych z NASH (85).
Choroby neurodegeneracyjne
Choroby neurodegeneracyjne tworzą heterogenną grupę zaburzeń, wrodzonych lub nabytych, charakteryzującą się stopniowym i selektywnym uszkodzeniem układu nerwowego w następstwie utraty neuronów. Przykładem choroby neurodegeneracyjnej jest choroba Alzheimera i choroba Parkinsona. Patogeneza tych chorób jest znana jedynie częściowo. Procesy, które prowadzą do obumierania i zanikania komórek nerwowych są złożone i zapewne stanowią efekt interakcji uwarunkowań genetycznych oraz działania czynników środowiskowych. Wiele wskazuje na istotną rolę zaburzeń mitochondrialnych w tym procesie.
U chorych z chorobami mitochondrialnymi zwyrodnienia tkanki nerwowej są częste. U osób powyżej 75 roku życia oraz chorych z chorobami neurodegeneracyjnymi w neuronach istoty czarnej występuje zwiększona liczba mutacji (w tym delecji) mtDNA (86, 87). Mutacje dotyczą także genów jądrowych związanych z funkcjonowaniem mitochondriów. Niektóre z nich mogą odpowiadać za dziedziczne uwarunkowania chorób neurodegeneracyjnych.
U chorych z chorobą Alzheimera nawet w ponad 50% przypadków znajdowano mutację t414g w regionie kontrolnym mtDNA, bezpośrednio związaną za zmianą profilu ekspresji genów MT-ND6/ND2 (88), a także liczby kopii mtDNA (22). W tej grupie chorych opisywano również dysfunkcje mitochondrialne powiązane z obniżoną aktywnością oksydazy cytochromu c w mózgu pacjentów (89, 90). Sugeruje się także, że miejscem bezpośredniej akumulacji amyloidu β w chorobie Alzheimera mogą być mitochondria, co prowadzi do ich dysfunkcji (91). Obserwacje te potwierdza wykrycie białka prekursorowego amyloidu β w połączeniu z mitochondrialnymi kanałami importu białek.
Mutacje w genach jądrowych, kodujących białka Pink1, DJ-1 i parkin, odpowiadające za występowanie części przypadków dziedzicznej choroby Parkinsona, w modelach zwierzęcych wywołują dysfunkcje mitochondrialne (92, 93, 94). Z kolei, mutacja genu SOD1, kodującego dysmutazę ponadtlenkową, jest powiązana z około 20% dziedzicznej odmiany stwardnienia zanikowego bocznego, która prowadzi do niszczenia komórek rogów przednich rdzenia kręgowego, jąder nerwów czaszkowych rdzenia przedłużonego oraz neuronów drogi piramidowej.
W tkankach, w których dojrzałe komórki zaprzestały podziałów mitotycznych, zmutowane mtDNA podlega preferencyjnej amplifikacji. W następstwie osłabienia procesów fosforylacji oksydacyjnej, może dochodzić do kompensacyjnej odpowiedzi jądrowej i wzmożonej biogenezy mitochondriów, w wyniku czego w tkance zwiększa się liczba kopii zmutowanego mtDNA. Wraz ze wzrostem ilości zmutowanego DNA produkcja energii ulega dalszemu obniżeniu, przy jednoczesnym zwiększeniu produkcji ROS, co z kolei zwiększa prawdopodobieństwo programowanej śmierci komórki. Wraz z apoptozą rosnącej liczby komórek, poziom uszkodzenia tkanki staje się widoczny i pojawiają się objawy chorobowe, np. chorób degeneracyjnych (29). W neuronach osób z chorobą Alzheimera obserwowano zmiany strukturalne w budowie mitochondriów, a u chorych z chorobą Alzheimera i chorobą Parkinsona stwierdzano zwiększoną liczbę neuronów, wykazujących dysfunkcję łańcucha oddechowego (86, 89). Zatem, choć mutacje mtDNA występują zazwyczaj w stanie heteroplazmii, to na skutek klonalnego powielania, liczba kopii uszkodzonego mtDNA w poszczególnych neuronach może przekroczyć wartość progową, skutkując zaburzeniem łańcucha oddechowego i prowadząc do zaburzeń obserwowanych w chorobach neurodegeneracyjnych (86, 87).
Również dla chorób neurodegeneracyjnych prowadzono badania asocjacji ryzyka wystąpienia choroby i przynależności do haplogrup mitochondrialnych. Wykazano, że częstość haplogrupy K jest istotnie niższa, a klaster grup JTIWX jest nadreprezentowany w grupie chorych z chorobą Parkinsona w stosunku do ogólnej populacji (95). Cechą charakterystyczną wymienionych haplogrup jest występowanie większej liczby polimorfizmów zmieniających kodowane aminokwasy w genach kodujących podjednostki kompleksu I łańcucha oddechowego (96). Na podobną zależność może wskazywać obserwowana u chorych z chorobą Parkinsona zwiększona częstość wariantu mt4216C charakterystycznego dla haplogrup J i T (97). Badania dotyczące asocjacji haplogrup i choroby Alzheimera nie wskazały powiązań przydanych w ocenie ryzyka zachorowania (98, 99, 100, 101), choć stwierdzano zależności dla pojedynczych polimorfizmów, podobnie zresztą jak w przypadku choroby Parkinsona (101, 102).
Choroby układu krążenia
Uważa się, że reakcje wolnorodnikowe mają znaczący wpływ na rozwój chorób układu sercowo-naczyniowego (103, 104, 105, 106, 107), co sugeruje potencjalne znaczenie zaburzeń mitochondrialnych również w tej grupie schorzeń.
W zdrowych komórkach mięśnia sercowego główną funkcją mitochondriów jest zapewnienie wystarczającej ilości ATP poprzez przemiany łańcucha oddechowego. Dlatego też miocyty zawierają zwiększoną liczbę mitochondriów zlokalizowanych w bezpośredniej bliskości mikrofibryli, co zapewnia system bezpośredniej dostawy ATP oraz utrzymania homeostazy jonów (108). W mitochondriach mięśnia sercowego szczególnie istotna wydaje się ich rola w zachowaniu homeostazy jonów Ca2+. Uszkodzeniom w niedokrwieniu/reperfuzji towarzyszy zwiększenie zawartości jonów Ca2+ w mitochondriach, mogące prowadzić do ich dysfunkcji, a nawet śmierci komórki.
Procesy śmierci komórki obserwowane są w kardiomiopatiach, niewydolności serca, uszkodzeniach związanych z niedokrwieniem/reperfuzją. We wszystkich tych stanach uszkodzenia komórek wiązane są ze stresem oksydacyjnym. Zwiększonej produkcji ROS mogą towarzyszyć także inne nieprawidłowości w mitochondriach – zmniejszona liczba kopii mtDNA, peroksydacja lipidów oraz obniżona aktywność enzymów łańcucha oddechowego (109). W istocie w wielu niezależnych badaniach dotyczących chorób układu krążenia wykazano występowanie ilościowych i jakościowych defektów mtDNA (110, 111, 112).
Mitochondria a proces starzenia
Starzenie się organizmu można definiować jako osłabianie struktury i funkcji komórek organizmu, postępujące wraz z upływem czasu, a będące naturalną konsekwencją entropii. Wraz z postępującym starzeniem się narasta akumulacja mutacji w mtDNA. Ponadto wykazano powiązanie długowieczności ze specyficznymi wariantami mtDNA, jak również z określonymi haplogrupami, np. haplogrupą J (114, 115). Jednak nie są to silne powiązania i nie zawsze udaje się je potwierdzić dla innej populacji (116).
Diagnostyka chorób mitochondrialnych
Niniejsza praca nie wyczerpuje zagadnień związanych z zaburzeniami funkcjonowania mitochondriów w patologii człowieka. Wybrane przykłady wskazują jednak, jak istotną rolę mogą one odgrywać. Najwięcej uwagi poświęcono genomowi mitochondrialnemu, który choć koduje tylko 37 spośród około 25 tysięcy wszystkich genów człowieka, jest niezbędny dla zachodzących w komórkach przemian energetycznych. Kodując białka kompleksów łańcucha oddechowego, mtDNA decyduje nie tylko o dostępności ATP i produkcji ciepła, ale także o towarzyszącej tym procesom produkcji reaktywnych form tlenu.
Rosnąca liczba publikacji wskazuje na znaczącą rolę polimorfizmów i mutacji mitochondrialnego DNA oraz wywołanych przez nie zaburzeń ekspresji genów mitochondrialnych w patogenezie chorób wieloczynnikowych (29, 38, 66, 77, 117). Autorzy wielu z tych badań postulują wykorzystanie molekularnych oznaczeń nieprawidłowości mitochondrialnych w praktyce klinicznej, do prognozowania ryzyka wystąpienia choroby (62, 63, 70, 101, 118), wczesnego wykrycia choroby (38, 42, 45, 46, 49, 60, 119) i przewidywania przebiegu choroby (44, 47, 58, 120).
Jedynym biochemicznym markerem dysfunkcji mitochondrialnej jest badanie stężenia mleczanów w płynach ustrojowych. Podwyższone stężenie mleczanów nie jest jednak ani swoiste dla dysfunkcji mitochondrialnych, ani nie występuje u wszystkich chorych z chorobami mitochondrialnymi. Charakterystyczne cechy genomu mitochondrialnego – z jednej strony duża liczba kopii w komórkach, z drugiej niewielkie wymiary – sprawiają, że zarówno izolacja, jak i badanie jego sekwencji wydaje się zadaniem prostym, czyniąc mtDNA atrakcyjnym celem technik molekularnych. Obecnie w badaniach molekularnych potwierdzenie rozpoznania choroby mitochondrialnej sprowadza się zazwyczaj do analizy sekwencji mtDNA w poszukiwaniu najczęściej występujących mutacji punktowych oraz delecji i rearanżacji mtDNA (121). Ze względu na ograniczony zakres analizy, wyniki tych testów często są negatywne i nie pozwalają na ustalenie molekularnego podłoża mitochondrialnej choroby.
Współczesne wielkoskalowe technologie sekwencjonowania umożliwiają badania rzadko występujących i nieznanych mutacji dla oceny zagrożenia chorobami nowotworowymi i zwyrodnieniowymi oraz zaburzeń związanych z procesami starzenia. Stały się one przedmiotem licznych badań naukowych, jednak jak dotąd nie znajdują praktycznego znaczenia. Nie dysponujemy bowiem odpowiednim zasobem wiedzy na temat ich znaczenia w rozwoju chorób wieloczynnikowych oraz nie potrafimy analizować i interpretować mechanizmów interakcji genomu mitochondrialnego i jądrowego w modyfikacji funkcji mitochondriów (38).
Rozczarowują również bazy danych, gromadzące tysiące sekwencji mtDNA, które w założeniu powinny stanowić podstawowe narzędzie, umożliwiające analizowanie i porównywanie wyników prac własnych z badaniami innych autorów. Okazuje się jednak, że znacząca część upublicznionych wyników jest obarczona błędami. Opublikowane przez Forstera w 2003 roku zestawienie wskazuje, że ponad 50% ówcześnie opisanych sekwencji mtDNA zawierało znaczące błędy (122). Błędy występują również w późniejszych pracach i mogą prowadzić do fałszywych interpretacji wyników analiz mitochondrialnych, które niestety są często powielane w kolejnych publikacjach (24, 64).
Należy także pamiętać o analitycznych ograniczeniach wynikających z natury badania uszkodzeń mtDNA. Nieprawidłowy wariant mtDNA może stanowić niewielki odsetek całkowitego mtDNA, a powstałe w trakcie życia chorego somatyczne mutacje mtDNA mogą występować jedynie w niektórych komórkach. Tym samym, najistotniejszy dla wyniku badania może okazać się dobór materiału biologicznego poddanego procedurom diagnostycznym (36).
Asocjacje haplogrup mitochondrialnych
Obiecującą dziedziną badań wydają się być próby określenia asocjacji mitochondrialnych haplogrup lub nawet pojedynczych polimorfizmów sekwencji mtDNA z ryzykiem zachorowania na określone choroby. Na korzyść takich badań przemawia łatwość opracowania testów molekularnych, możliwych do wykorzystania w praktyce klinicznej. Do tej pory udało się wykazać, że przynależność do określonych haplogrup wiąże się z wyższym ryzykiem rozwoju chorób nowotworowych oraz wielu chorób związanych z procesami starzenia.
Próby powiązania zmian w mtDNA z powstawaniem chorób napotykają jednak nadal na wiele trudności. Pierwszy problem wynika z tego, iż geograficzna dystrybucja haplogrup nie jest w populacji jednorodna. Powoduje to, że dla uzyskania reprezentacji całej populacji, badane grupy muszą być dobierane z dużych obszarów, takich samych dla grupy badanej i kontrolnej (38).
Drugim problemem w badaniach asocjacyjnych są znaczne różnice w liczebności haplogrup. Przykładowo, wśród 8 najczęstszych haplogrup w polskiej populacji, dwie najliczniejsze – H (43%) i U (17%) – występują w ponad połowie badanych przypadków, a kolejne stanowią odpowiednio: T (11%), J (8%), V (6%), K (4%), W (3%) i I (2%) (123). Powstaje zatem ryzyko, że mała liczba osób badanych, reprezentujących mniej liczne haplogrupy, wpłynie na wartość testów statystycznych prowadząc do fałszywie pozytywnych wyników (124). Często oznacza to konieczność łączenia haplogrup na potrzeby analizy statystycznej, co może prowadzić do utraty części informacji. Dla uniknięcia tego problemu konieczne jest prowadzenie badań w grupach, liczących tysiące osób grupy badanej i kontrolnej (38). Wykrycie asocjacji staje się więc kosztowne, a zebranie odpowiednio dużej liczby przypadków, reprezentujących niektóre rzadsze choroby, może okazać się niemożliwe.
Piśmiennictwo
1. Busch KB et al.: Mitochondrial dynamics generate equal distribution but patchwork localization of respiratory Complex I. Mol Membr Biol 2006; 23: 509-20.
2. Kotulska A, Kucharz EJ: Miopatie mitochondrialne. Terapia 2004; 5(152): 43-8.
3. Genova ML, Bianchi C, Lenaz G: Supercomplex organization of the mitochondrial respiratory chain and the role of the Coenzyme Q pool: pathophysiological implications. Biofactors 2005; 25: 5-20.
4. Czarna M, Jarmuszkiewicz W: Role of mitochondria in reactive oxygen species generation and removal; relevance to signaling and programmed cell death. Postepy Biochem 2006; 52: 145-56.
5. Stone JR, Yang S: Hydrogen peroxide: a signaling messenger. Antioxid Redox Signal 2006; 8: 243-70.
6. Newmeyer DD, Ferguson-Miller S: Mitochondria: releasing power for life and unleashing the machineries of death. Cell 2003; 112: 481-90.
7. Gradzka I: Mechanisms and regulation of the programmed cell death. Postępy Biochem 2006; 52: 157-65.
8. Orrenius S, Gogvadze V, Zhivotovsky B: Mitochondrial oxidative stress: implications for cell death. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007; 47: 143-83.
9. Wojtczak L, Zabłocki K: Mitochondria w życiu, chorobie i śmierci komórki. Postepy Biochem 2008; 54: 129-41.
10. Dyall SD, Brown MT, Johnson PJ: Ancient invasions: from endosymbionts to organelles. Science 2004; 304: 253-7.
11. Legros F et al.: Organization and dynamics of human mitochondrial DNA. J Cell Sci 2004; 117: 2653-62.
12. Anderson S et al.: Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 1981; 290: 457-65.
13. Pfanner N, Geissler A: Versatility of the mitochondrial protein import machinery. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 339-49.
14. Holt IJ, Lorimer HE, Jacobs HT: Coupled leading- and lagging-strand synthesis of mammalian mitochondrial DNA. Cell 2000; 100: 515-24.
15. Brown TA et al.: Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-strand origins, not via a strand-coupled mechanism. Genes Dev 2005; 19: 2466-76.
16. Montoya J et al.: Identification of initiation sites for heavy-strand and light-strand transcription in human mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1982; 79: 7195-9.
17. Asin-Cayuela J, Gustafsson CM: Mitochondrial transcription and its regulation in mammalian cells. Trends Biochem Sci 2007; 32: 111-7.
18. Bonawitz ND, Clayton DA, Shadel GS: Initiation and beyond: multiple functions of the human mitochondrial transcription machinery. Mol Cell 2006; 24: 813-25.
19. Wallace DC: Mitochondrial DNA sequence variation in human evolution and disease. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 8739-46.
20. Tully G et al.: Considerations by the European DNA profiling (EDNAP) group on the working practices, nomenclature and interpretation of mitochondrial DNA profiles. Forensic Sci Int 2001; 124: 83-91.
21. Cadet J et al.: Oxidative damage to DNA: formation, measurement, and biological significance. Rev Physiol Biochem Pharmacol 1997; 131: 1-87.
22. Coskun PE, Beal MF, Wallace DC: Alzheimer´s brains harbor somatic mtDNA control-region mutations that suppress mitochondrial transcription and replication. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 10726-31.
23. Schwartz M, Vissing J: Paternal inheritance of mitochondrial DNA. N Engl J Med 2002; 347: 576-80.
24. Bandelt HJ et al.: More evidence for non-maternal inheritance of mitochondrial DNA? J Med Genet 2005; 42: 957-60.
25. Macaulay V et al.: The emerging tree of West Eurasian mtDNAs: a synthesis of control-region sequences and RFLPs. Am J Hum Genet 1999; 64: 232-49.
26. Kivisild T et al.: The role of selection in the evolution of human mitochondrial genomes. Genetics 2006; 172: 373-87.
27. Mishmar D et al.: Natural selection shaped regional mtDNA variation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 171-6.
28. Ruiz-Pesini E et al.: Effects of purifying and adaptive selection on regional variation in human mtDNA. Science 2004; 303: 223-6.
29. Wallace DC: A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet 2005; 39: 359-407.
30. Ostrowski J: Molecular medicine of the future-applications and pitfalls. Acta Pol Pharm 2006; 63: 329-32.
31. Hall WD, Morley KI, Lucke JC: The prediction of disease risk in genomic medicine. EMBO Rep 2004; 5 Spec No: S22-6.
32. DiMauro S: The many faces of mitochondrial diseases. Mitochondrion 2004; 4: 799-807.
33. Luft R et al.: A case of severe hypermetabolism of nonthyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control: a correlated clinical, biochemical, and morphological study. J Clin Invest 1962; 41: 1776-804.
34. Trebinska A, Golik P: Choroby mitochondrialne wywołane zaburzeniami w komunikacji między genomem jądrowym i organellarnym. Postępy Biochem 2004; 50: 45-56.
35. Filosto M, Mancuso M: Mitochondrial diseases: a nosological update. Acta Neurol Scand 2007; 115: 211-21.
36. Wong LJ: Diagnostic challenges of mitochondrial DNA disorders. Mitochondrion 2007; 7: 45-52.
37. DiMauro S: Mitochondrial DNA medicine. Biosci Rep 2007; 27: 5-9.
38. Raule N et al.: Association studies on human mitochondrial DNA: methodological aspects and results in the most common age-related diseases. Mitochondrion 2007; 7: 29-38.
39. Potargowicz E et al.: Mitochondria jako źródło reaktywnych form tlenu. Postepy Hig Med Dosw (Online) 2005; 59: 259-66.
40. Pelicano H, Carney D, Huang P: ROS stress in cancer cells and therapeutic implications. Drug Resist Updat 2004; 7: 97-110.
41. Brandon M, Baldi P, Wallace DC: Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene 2006; 25: 4647-62.
42. Parrella P et al.: Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates. Cancer Res 2001; 61: 7623-6.
43. Richard SM et al.: Nuclear and mitochondrial genome instability in human breast cancer. Cancer Res 2000; 60: 4231-7.
44. Tseng LM et al.: Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in breast cancer. Genes Chromosomes Cancer 2006; 45: 629-38.
45. Zhu W et al.: Mitochondrial DNA mutations in breast cancer tissue and in matched nipple aspirate fluid. Carcinogenesis 2005; 26: 145-52.
46. Parr RL et al.: Somatic mitochondrial DNA mutations in prostate cancer and normal appearing adjacent glands in comparison to age-matched prostate samples without malignant histology. J Mol Diagn 2006; 8: 312-9.
47. Petros JA et al.: mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 719-24.
48. Kose K et al.: Somatic mutations of mitochondrial DNA in digestive tract cancers. J Gastroenterol Hepatol 2005; 20: 1679-84.
49. Sui G et al.: Mitochondrial DNA mutations in preneoplastic lesions of the gastrointestinal tract: a biomarker for the early detection of cancer. Mol Cancer 2006; 5: 73.
50. Wu CW et al.: Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer. Genes Chromosomes Cancer 2005; 44: 19-28.
51. Zhao YB et al.: Mutation in D-loop region of mitochondrial DNA in gastric cancer and its significance. World J Gastroenterol 2005; 11: 3304-6.
52. Abnet CC et al.: Control region mutations and the "common deletion" are frequent in the mitochondrial DNA of patients with esophageal squamous cell carcinoma. BMC Cancer 2004; 4: 30.
53. Tan DJ et al.: Significance of somatic mutations and content alteration of mitochondrial DNA in esophageal cancer. BMC Cancer 2006; 6: 93.
54. Nishikawa M et al.: Somatic mutation of mitochondrial DNA in cancerous and noncancerous liver tissue in individuals with hepatocellular carcinoma. Cancer Res 2001; 61: 1843-5.
55. Van Trappen PO et al.: Somatic mitochondrial DNA mutations in primary and metastatic ovarian cancer. Gynecol Oncol 2007; 104: 129-33.
56. Bonora E et al.: Defective oxidative phosphorylation in thyroid oncocytic carcinoma is associated with pathogenic mitochondrial DNA mutations affecting complexes I and III. Cancer Res 2006; 66: 6087-96.
57. Maximo V et al.: Mitochondrial DNA somatic mutations (point mutations and large deletions) and mitochondrial DNA variants in human thyroid pathology: a study with emphasis on Hurthle cell tumors. Am J Pathol 2002; 160: 1857-65.
58. He L et al.: Somatic mitochondrial DNA mutations in adult-onset leukaemia. Leukemia 2003; 17: 2487-91.
59. Yao YG et al.: Mitochondrial DNA sequence variation in single cells from leukemia patients. Blood 2007; 109: 756-62.
60. Ha PK et al.: Mitochondrial C-tract alteration in premalignant lesions of the head and neck: a marker for progression and clonal proliferation. Clin Cancer Res 2002; 8: 2260-5.
61. Mithani SK et al.: Mitochondrial mutations are a late event in the progression of head and neck squamous cell cancer. Clin Cancer Res 2007; 13: 4331-5.
62. Darvishi K et al.: Mitochondrial DNA G10398A polymorphism imparts maternal Haplogroup N a risk for breast and esophageal cancer. Cancer Lett 2007; 249: 249-55.
63. Booker LM et al.: North American white mitochondrial haplogroups in prostate and renal cancer. J Urol 2006; 175: 468-72; discussion 72-3.
64. Salas A et al.: A critical reassessment of the role of mitochondria in tumorigenesis. PLoS Med 2005; 2: e296.
65. Zanssen S, Schon EA. Mitochondrial DNA mutations in cancer. PLoS Med 2005; 2: e401.
66. Czarnecka AM et al.: Cancer as a "Mitochondriopathy”. J Cancer Mol 2007; 3: 71-9.
67. Kelley DE et al.: Dysfunction of mitochondria in human skeletal muscle in type 2 diabetes. Diabetes 2002; 51: 2944-50.
68. Alcolado JC, Laji K, Gill-Randall R: Maternal transmission of diabetes. Diabet Med 2002; 19: 89-98.
69. Mohlke KL et al.: Mitochondrial polymorphisms and susceptibility to type 2 diabetes-related traits in Finns. Hum Genet 2005; 118: 245-54.
70. Poulton J et al.: Type 2 diabetes is associated with a common mitochondrial variant: evidence from a population-based case-control study. Hum Mol Genet 2002; 11: 1581-3.
71. Sherratt EJ et al.: Mitochondrial DNA variations in patients with Type 2 (non-insulin dependent) diabetes mellitus and a Welsh control population. Mutation in brief no. 239. Online. Hum Mutat 1999; 13: 412-3.
72. Angulo P: Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002; 346: 1221-31.
73. Patrick L: Nonalcoholic fatty liver disease: relationship to insulin sensitivity and oxidative stress. Treatment approaches using vitamin E, magnesium, and betaine. Altern Med Rev 2002; 7: 276-91.
74. Begriche K et al.: Mitochondrial dysfunction in NASH: causes, consequences and possible means to prevent it. Mitochondrion 2006; 6: 1-28.
75. Caldwell SH et al.: Mitochondrial abnormalities in non-alcoholic steatohepatitis. J Hepatol 1999; 31: 430-4.
76. Sanyal AJ et al.: Nonalcoholic steatohepatitis: association of insulin resistance and mitochondrial abnormalities. Gastroenterology 2001; 120: 1183-92.
77. Pessayre D, Fromenty B: NASH: a mitochondrial disease. J Hepatol 2005; 42: 928-40.
78. Pessayre D, Fromenty B, Mansouri A: Mitochondrial injury in steatohepatitis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2004; 16: 1095-105.
79. Cortez-Pinto H et al.: Alterations in liver ATP homeostasis in human nonalcoholic steatohepatitis: a pilot study. Jama 1999; 282: 1659-64.
80. St-Pierre J et al.: Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. J Biol Chem 2002; 277: 44784-90.
81. Kushnareva Y, Murphy AN, Andreyev A: Complex I-mediated reactive oxygen species generation: modulation by cytochrome c and NAD(P)+ oxidation-reduction state. Biochem J 2002; 368: 545-53.
82. Chen J et al.: Formation of malondialdehyde adducts in livers of rats exposed to ethanol: role in ethanol-mediated inhibition of cytochrome c oxidase. Alcohol Clin Exp Res 2000; 24: 544-52.
83. Chen J et al.: Inhibition of cytochrome c oxidase activity by 4-hydroxynonenal (HNE). Role of HNE adduct formation with the enzyme subunits. Biochim Biophys Acta 1998; 1380: 336-44.
84. Perez-Carreras M et al.: Defective hepatic mitochondrial respiratory chain in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2003; 38: 999-1007.
85. Kawahara H et al.: Mutation of mitochondrial DNA in livers from patients with alcoholic hepatitis and nonalcoholic steatohepatitis. Alcohol Clin Exp Res 2007; 31: S54-60.
86. Bender A et al.: High levels of mitochondrial DNA deletions in substantia nigra neurons in aging and Parkinson disease. Nat Genet 2006; 38: 515-7.
87. Kraytsberg Y et al.: Mitochondrial DNA deletions are abundant and cause functional impairment in aged human substantia nigra neurons. Nat Genet 2006; 38: 518-20.
88. Coskun PE, Ruiz-Pesini E, Wallace DC: Control region mtDNA variants: longevity, climatic adaptation, and a forensic conundrum. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 2174-6.
89. Cottrell DA et al.: Mitochondrial enzyme-deficient hippocampal neurons and choroidal cells in AD. Neurology 2001; 57: 260-4.
90. Gu M et al.: Mitochondrial function, GSH and iron in neurodegeneration and Lewy body diseases. J Neurol Sci 1998; 158: 24-9.
91. Manczak M et al.: Mitochondria are a direct site of A beta accumulation in Alzheimer´s disease neurons: implications for free radical generation and oxidative damage in disease progression. Hum Mol Genet 2006; 15: 1437-49.
92. Clark IE et al.: Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature 2006; 441: 1162-6.
93. Palacino JJ et al.: Mitochondrial dysfunction and oxidative damage in parkin-deficient mice. J Biol Chem 2004; 279: 18614-22.
94. Andres-Mateos E et al.: DJ-1 gene deletion reveals that DJ-1 is an atypical peroxiredoxin-like peroxidase. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: 14807-12.
95. Ghezzi D et al.: Mitochondrial DNA haplogroup K is associated with a lower risk of Parkinson´s disease in Italians. Eur J Hum Genet 2005; 13: 748-52.
96. Autere J et al.: Mitochondrial DNA polymorphisms as risk factors for Parkinson´s disease and Parkinson´s disease dementia. Hum Genet 2004; 115: 29-35.
97. Ross OA et al.: mt4216C variant in linkage with the mtDNA TJ cluster may confer a susceptibility to mitochondrial dysfunction resulting in an increased risk of Parkinson´s disease in the Irish. Exp Gerontol 2003; 38: 397-405.
98. Chinnery PF et al.: Mitochondrial DNA haplogroups and susceptibility to AD and dementia with Lewy bodies. Neurology 2000; 55: 302-4.
99. Elson JL et al.: Does the mitochondrial genome play a role in the etiology of Alzheimer´s disease? Hum Genet 2006; 119: 241-54.
100. van der Walt JM et al.: Analysis of European mitochondrial haplogroups with Alzheimer disease risk. Neurosci Lett 2004; 365: 28-32.
101. van der Walt JM et al.: Mitochondrial polymorphisms significantly reduce the risk of Parkinson disease. Am J Hum Genet 2003; 72: 804-11.
102. Huerta C et al.: Mitochondrial DNA polymorphisms and risk of Parkinson´s disease in Spanish population. J Neurol Sci 2005; 236: 49-54.
103. Paravicini TM, Touyz RM: NADPH oxidases, reactive oxygen species, and hypertension: clinical implications and therapeutic possibilities. Diabetes Care 2008; 31 Suppl 2: S170-80.
104. Vaziri ND, Rodriguez-Iturbe B: Mechanisms of disease: oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of hypertension. Nat Clin Pract Nephrol 2006; 2: 582-93.
105. Moukdar F et al.: Reduced antioxidant capacity and diet-induced atherosclerosis in uncoupling protein-2-deficient mice. J Lipid Res 2008;
106. Hill MF, Singal PK: Antioxidant and oxidative stress changes during heart failure subsequent to myocardial infarction in rats. Am J Pathol 1996; 148: 291-300.
107. Ide T et al.: Direct evidence for increased hydroxyl radicals originating from superoxide in the failing myocardium. Circ Res 2000; 86: 152-7.
108. Andrienko T et al.: Metabolic consequences of functional complexes of mitochondria, myofibrils and sarcoplasmic reticulum in muscle cells. J Exp Biol 2003; 206: 2059-72.
109. Ide T et al.: Mitochondrial DNA damage and dysfunction associated with oxidative stress in failing hearts after myocardial infarction. Circ Res 2001; 88: 529-35.
110. Corral-Debrinski M, Shoffner JM, Lott MT, Wallace DC: Association of mitochondrial DNA damage with aging and coronary atherosclerotic heart disease. Mutat Res 1992; 275: 169-80.
111. Kajander OA, Karhunen PJ, Jacobs HT: The relationship between somatic mtDNA rearrangements, human heart disease and aging. Hum Mol Genet 2002; 11: 317-24.
112. Lebrecht D et al.: Time-dependent and tissue-specific accumulation of mtDNA and respiratory chain defects in chronic doxorubicin cardiomyopathy. Circulation 2003; 108: 2423-9.
113. De Benedictis G et al.: Mitochondrial DNA inherited variants are associated with successful aging and longevity in humans. Faseb J 1999; 13: 1532-6.
114. Ross OA et al.: Mitochondrial DNA polymorphism: its role in longevity of the Irish population. Exp Gerontol 2001; 36: 1161-78.
115. Niemi AK et al.: Mitochondrial DNA polymorphisms associated with longevity in a Finnish population. Hum Genet 2003; 112: 29-33.
116. Dato S et al.: Association of the mitochondrial DNA haplogroup J with longevity is population specific. Eur J Hum Genet 2004; 12: 1080-2.
117. Penta JS et al.: Mitochondrial DNA in human malignancy. Mutat Res 2001; 488: 119-33.
118. Fuku N et al.: Mitochondrial haplogroup N9a confers resistance against type 2 diabetes in Asians. Am J Hum Genet 2007; 80: 407-15.
119. Birch-Machin MA: Using mitochondrial DNA as a biosensor of early cancer development. Br J Cancer 2005; 93: 271-2.
120. Aikhionbare FO, et al.: Is cumulative frequency of mitochondrial DNA variants a biomarker for colorectal tumor progression? Mol Cancer 2004; 3: 30.
121. Wong LJ, Boles RG: Mitochondrial DNA analysis in clinical laboratory diagnostics. Clin Chim Acta 2005; 354: 1-20.
122. Forster P: To err is human. Ann Hum Genet 2003; 67: 2-4.
123. Piechota J et al.: Comparison between the Polish population and European populations on the basis of mitochondrial morphs and haplogroups. Acta Biochim Pol 2004; 51: 883-95.
124. Roff DA, Bentzen P: The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: chi 2 and the problem of small samples. Mol Biol Evol 1989; 6: 539-45.
otrzymano: 2008-12-03
zaakceptowano do druku: 2009-01-07

Adres do korespondencji:
*Jerzy Ostrowski Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego,
Klinika Gastroenterologii i Hepatologii w Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa
tel.: (0-22) 546-25-75
e-mail: jostrow@warman.com.pl

Postępy Nauk Medycznych 2/2009
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych