Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 2/2009, s. 149-156
Jakub Karczmarski, Michał Mikula, Ewa Hennig, Tymon Rubel, *Jerzy Ostrowski
Perspektywy poszukiwania biomarkerów chorobowych w peptydomie osocza lub surowicy krwi z użyciem spektrometrii mas
Perspectives of mass spectrometry-based disease biomarkers discovery in plasma or serum peptidome
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Klinika Gastroenterologii i Hepatologii w Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. Jarosław Reguła
Streszczenie
Dzięki ogromnemu postępowi, jaki dokonuje się w technikach proteomicznych, a w szczególności w spektrometrii mas, proteomika jest powszechnie uważana za niezwykle obiecującą technologię w badaniach biomedycznych. Jednym z jej głównych zastosowań stało się poszukiwanie biologicznych markerów chorobowych. Klinicznie przydatny marker powinien być łatwo mierzalny w tkance lub płynie ustrojowym, których pobranie nie powinno być uciążliwe dla chorego, a tym samym badanie diagnostyczne lub predykcyjne powinno być w pełni przez niego akceptowane. Badanie niskocząsteczkowego proteomu osocza i surowicy zyskuje coraz większe zainteresowanie, gdyż uważa się, że to właśnie w tym obszarze nazwanym peptydomem, mogą znajdować się nowe, jeszcze nie odkryte biomarkery. Celem tego artykułu jest przegląd najnowszych metod i trendów w badaniu proteomu/peptydomu osocza i surowicy oraz przedstawienie możliwości i ograniczeń zastosowania spektrometrii mas do poszukiwania peptydowych biomarkerów chorobowych, w szczególności w onkologii.
Summary
Recent immense progress in proteomic technologies, especially in mass spectrometry, makes proteomics a promising field for biomedical research. One of rapidly developing branches in proteomics is the discovery of biological disease markers. Clinically useful biomarkers should be easily detectable in tissues or in bodily fluids that are accessible for sampling without subsequent inconvenience to a patient. The low molecular weight fraction of plasma and serum, called peptidome, is gaining a growing interest, as it is considered to be the source of currently undiscovered biomarkers. This article intends to review the newest methods and trends in plasma and serum peptidome research and to show capabilities and limitations as well as current applications of mass spectrometry in peptide disease biomarker discovery, taking a special focus on oncology.
WPROWADZENIE
Termin proteomika po raz pierwszy został użyty w 1994 roku i w analogii do genomiki, oznaczał zakrojone na szeroką skalę badania mające na celu poznanie ogółu białek komórkowych (1). Dzisiaj proteomika zajmuje się również określaniem struktury, izoform oraz modyfikacji potranslacyjnych białek, badaniem mechanizmów aktywności, funkcji i usytuowania białek w szlakach metabolicznych komórki, a także analizą interakcji z innymi białkami, struktury tworzonych kompleksów oraz ich lokalizacji śródkomórkowej.
Jedną z podstawowych technik stosowanych w proteomice jest spektrometria mas (MS), ponieważ pozwala ona na pomiar masy cząsteczek w stężeniach attomolowych, do niedawna nieosiągalnych w analizie. Spektrometr mas składa się z trzech podstawowych części: źródła jonów, analizatora rozdzielającego jony pod względem stosunków ich masy do ładunku oraz detektora zliczającego liczbę jonów danego rodzaju. Bardzo szybki rozwój tej techniki został zapoczątkowany w latach 90-tych, dzięki wprowadzeniu nowych technik jonizacji, takich jak:
– jonizacja przez desorpcję laserową w matrycy (MALDI, ang. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation), w której stosuje się jonizację wiązką laserową o tak dobranej energii, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (tzw. metoda łagodnej jonizacji), a jedynie do ich „wybijania” ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która następnie jest przekazywana do analizowanych cząsteczek (2),
– elektrorozpylanie (ESI, ang. Electrospray), polegające na rozpylaniu cieczy, zawierającej badaną substancję, w polu elektrycznym o wysokim napięciu (zwykle 1-5 kV). Jest to również technika łagodnej jonizacji – zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek (2).
Za pionierskie prace nad ESI i MALDI, John Fenn i Koichi Tanaki zostali uhonorowani w 2002 roku nagrodą Nobla w dziedzinie chemii (3). Dalsze zwiększenie czułości analiz w MS osiągnięto dzięki sprzężeniu ESI, a od niedawna również MALDI, z chromatografią cieczową (4).
Dzięki ogromnemu postępowi, jaki dokonuje się w technikach proteomicznych, a w szczególności w MS, proteomika jest powszechnie uważana za niezwykle obiecującą technologię w badaniach biomedycznych. Jednym z jej głównych zastosowań stało się poszukiwanie biologicznych markerów chorobowych. Szczególnie interesującym źródłem biomarkerów mogą być płyny ustrojowe. Będąc w stałym i bliskim kontakcie z tkankami, płyny ustrojowe stają się rezerwuarem polipeptydów wydzielanych przez tkanki, a ich skład zależy od metabolicznego stanu organizmu. Dodatkowo, pobieranie płynów ustrojowych cechuje niska inwazyjność i niewielkie koszty oraz łatwość przechowywania próbek i ich przetwarzania. Jednakże odkrycie nowych biomarkerów chorobowych wymaga zrozumienia specyfiki płynów ustrojowych oraz ścisłej standaryzacji wielu etapów analizy.
MOŻLIWOŚCI I OGRANICZENIA SPEKTROMETRII MAS W BADANIACH BIOMEDYCZNYCH
Osocze i surowica krwi jako potencjalne źródło biomarkerów
Liczba i skład polipeptydów w krwioobiegu zmienia się dynamicznie w zależności od stanu organizmu, odzwierciedlając zachodzące w nim zmiany, tak fizjologiczne, jak i chorobowe (5). Docierając do wszystkich regionów ciała, krew zbiera z tkanek wydzielane komórkowe białka i metabolity, stając się potencjalnie ważnym źródłem biomarkerów chorobowych.
Dla poszukiwania markerów białkowych we krwi ważny jest wybór czy źródłem białek będzie osocze czy też surowica, bowiem ich składy białkowe w dużym stopniu różnią się od siebie (6). Różnica ta wynika przede wszystkim z usunięcia z surowicy znacznych ilości fibrynogenu oraz białek specyficznie bądź niespecyficznie związanych z procesem wykrzepiania krwi.
Grupy badawcze skupione w międzynarodowej organizacji HUPO (ang. Human Proteome Organisation), na podstawie wyników otrzymanych w pilotażowej fazie projektu Proteom Osocza (ang. Plasma Proteome Project), rekomendują używanie do badań osocza zamiast surowicy krwi, ze względu na niższy poziom degradacji białek zachodzącej ex vivo, a tym samym większą stabilność składu białkowego próbek (7). Jednakże coraz częściej pojawiają się również opinie przemawiające za stosowaniem surowicy jako źródła potencjalnych biomarkerów peptydowych, właśnie ze względu na procesy zachodzące ex vivo, które według zwolenników stosowania do badań surowicy wydają się być jednym z mechanizmów generowania biomarkerów (8). Tak więc, oprócz wątpliwości: co i jak pobierać, jak transportować, jak przechowywać i jak wstępnie przygotowywać próbki do analizy, rodzi się kolejne pytanie: badać proteom czy peptydom, osocza czy surowicy?
Standaryzacja procedur przygotowania prób do analiz
W badaniach proteomów osocza i surowicy krwi w poszukiwaniu biomarkerów niezmiernie ważna jest powtarzalność eksperymentów i możliwość odtworzenia wyników analiz w innych ośrodkach badawczych. Badania własne i innych autorów wskazują, że czas i temperatura wykrzepiania krwi, wielokrotność rozmrażania i zamrażania próbek surowicy, a także rodzaj i ilość stosowanych inhibitorów proteaz (niektóre z nich mogą interferować z analizą w spektrometrze mas) mają znaczący wpływ na uzyskiwane wyniki analiz (9, 10). Cel, jaki stawia sobie HUPO, upowszechniając swoje wyniki i obserwacje, to m.in. opracowanie standardowych protokołów i metod, które umożliwią porównywanie wyników otrzymanych w różnych laboratoriach.
Dynamiczny zakres stężeń białek krwi
Proteomy surowicy i osocza krwi charakteryzuje złożony skład oraz dynamiczny zakres stężeń występujących w nich białek. Ich pełną analizę proteomiczną istotnie utrudnia obecność kilku białek, które występują w bardzo wysokich stężeniach. Do tych białek zaliczamy m.in. albuminę, immunoglobuliny, alfa-1-antytrypsynę, fibrynogen, transferynę oraz haptoglobinę. Szacuje się, że zaledwie 22 białka stanowią niemal 99% masy białkowej osocza i surowicy (ryc. 1). Sama albumina stanowi ponad 50% masy białkowej, a poziom jej stężenia w surowicy w porównaniu z białkami sygnałowymi, występującymi w ilościach śladowych, przekracza 10 rzędów wielkości (5). Podczas rutynowej analizy proteomicznej, peptydy uzyskiwane z białek najczęściej występujących całkowicie maskują obecność peptydów pochodzących z białek o niższym stężeniu, wśród których spodziewamy się znaleźć biomarkery. Dlatego też poszukiwanie potencjalnych biomarkerów peptydowych wymaga usunięcia z analizowanej mieszaniny białek występujących w niej w dużych stężeniach, np. poprzez stosowanie kolumn wypełnionych złożem z przeciwciałami skierowanymi przeciwko najczęściej występującym białkom krwi (6).
Ryc. 1. Udział najczęściej występujących białek krwi, wg Tirumalai i wsp. (11).
Metody poszukiwania biomarkerów z użyciem spektrometrii mas
Prosty eksperyment z użyciem tandemowego spektrometru mas sprzężonego z wysokosprawną chromatografią cieczową (LC-MS/MS) zazwyczaj generuje listę kilkuset białek. Dla pełniejszej identyfikacji proteomu stosuje się złożone, wieloetapowe metody proteomiczne, które najczęściej obejmują wstępne frakcjonowanie białek, wielowymiarowy rozdział polipeptydów i ich ostateczną identyfikację w MS. W tabeli 1 przedstawiono przykłady różnych połączeń technik proteomicznych stosowanych w badaniach proteomów surowicy i osocza wraz z liczbą zidentyfikowanych w nich białek.
Tabela 1. Przykłady zastosowania różnych technik proteomicznych do badania białek krwi.
Badany proteomZastosowana metodologiaLiczba zidentyfikowanych białekPiśmiennictwo
surowicaSCX*/LC-IT MS490(49)
osoczeNano-LC/IT MS800-1682(50)
surowicawstępne frakcjonowanie SEC, AEC LC-ESI-MS/MS742(51)
osocze/surowicawstępne frakcjonowanie IEF,1DE RPLC-MS/MS575 (osocze)
2890 (surowica)
(52)
surowicaIEF/LC-MS/MS437(13)
surowicawstępne frakcjonowanie IEF-SCX LC-MS/MS1444(14)
surowicaLC-FT-ICR MS722(53)
osoczewstępne frakcjonowanie SCX RPLC-MS/MS804(54)
osocze/surowicaLAC/LC-MS/MS150 (białka glikozylowane)(20)
osoczeSCX-RPLC-MS/MS303 (białka glikozylowane)(22)
*SCX – chromatografia kationowymienna, LC – chromatografia cieczowa, IT – pułapka jonowa, MS – spektrometria mas, SEC – chromatografia wykluczania, AEC – chromatografia anionowymienna, ESI – elektrorozpylanie, IEF – izoelektroogniskowanie, 1DE – elektroforeza w denaturującym żelu poliakryloamidowym, RPLC – chromatografia cieczowa w odwróconej fazie, LAC – chromatografia powinowactwa z użyciem lektyn, FT-ICR – analizator cyklotronowego rezonansu jonów z furierowską transformacją wyników.
Do najczęściej stosowanych metod frakcjonowania białek osocza i surowicy należą: chromatografia cieczowa w odwróconej fazie (RPLC), chromatografia jonowymienna (kationowymienna SCX i anionowymienna AEC), chromatografia wykluczania (SEC), elektroforeza w denaturującym żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE), elektroforeza kapilarna (EC) i izoelektroogniskowanie (IEF) (6). Łączenie ze sobą różnych technik frakcjonowania może dodatkowo zwiększać ich rozdzielczość, pozwalając na wielowymiarowe frakcjonowanie próbek i dalsze upraszczanie ich składu białkowego przed analizą MS.
W projekcie HUPO/PPP przeprowadzono szereg porównań w celu uzyskania najbardziej wydajnej metody frakcjonowania białek, poprzedzającej analizę MS. Okazało się, że na identyfikację największej liczby białek surowicy pozwalają metody sprzężone z SCX oraz z IEF, ponadto każda z tych metod identyfikuje z osobna białka dla siebie unikatowe (12). W eksperymencie, w którym połączono IEF z LC-MS/MS zidentyfikowano w surowicy 844 peptydy, które odpowiadały 437 białkom (13), natomiast połączenie IEF z SCX i LC-MS/MS pozwoliło na rozpoznane aż 1444 białek (14). We wstępnym podsumowaniu projektu PPP, HUPO przedstawiła listę 9504 białek zidentyfikowanych na podstawie co najmniej jednego peptydu, w tym 3020 białek identyfikowanych na podstawie co najmniej dwóch peptydów (7).
Niskocząsteczkowy proteom krwi
Badanie niskocząsteczkowego proteomu osocza i surowicy zyskuje coraz większe zainteresowanie, gdyż uważa się, że to właśnie w tym obszarze proteomu, nazwanym peptydomem, mogą znajdować się nowe, jeszcze nie odkryte biomarkery. Za „niskocząsteczkową frakcję” proteomu krwi przyjęto uważać peptydy i białka o masie poniżej 30 kDa (15). W jej skład wchodzi szereg ważnych fizjologicznie białek, takich jak: cytokiny, chemokiny, białkowe hormony i czynniki wzrostu. Peptydy występujące w krwioobiegu mogą także powstawać jako produkty degradacji białek, w wyniku aktywności endogennych proteaz (16). Frakcję niskocząsteczkową proteomu krwi można otrzymać przez usunięcie polipeptydów o masie powyżej 30 kDa, stosując kolumny filtracyjne o takim punkcie odcięcia. W celu uwolnienia polipeptydów związanych przez wysokocząsteczkowe białka nośnikowe, filtrowanie przeprowadza się w warunkach denaturujących (15).
Wiele składników niskocząsteczkowego proteomu krwi jest związanych z białkami nośnikowymi, do których zaliczamy przede wszystkim albuminę. Uważa się, że albumina pełni rolę „gąbki molekularnej” dla peptydów i niskocząsteczkowych białek, dzięki czemu nie są one usuwane przez układ filtracyjny nerek i dłużej pozostają w krwioobiegu (17). Dla przykładu, w osoczu chorych na raka jajnika wyróżniono ponad 800 peptydów wiązanych przez albuminę, w tym fragmenty białka komórkowego BRCA2 (18). Wydaje się więc, że frakcja niskocząsteczkowych białek i peptydów wiązanych przez białka nośnikowe, może również stanowić ważne źródło potencjalnych biomarkerów chorobowych.
Białka glikozylowane
Izolowanie białek podlegających specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym łańcuchów bocznych aminokwasów, stanowi jedno z możliwych podejść do badania białek obecnych we krwi w niskich stężeniach. Modyfikacje te odgrywają zasadniczą rolę w regulacji wielu podstawowych procesów biologicznych, a zaburzenie ich normalnego przebiegu ma wpływ na powstawanie wielu chorób, w tym również nowotworowych. Glikozylacja jest jedną z najczęściej występujących modyfikacji białek, a zmiany w składzie podstawianych reszt wielocukrowych wydają się być specyficzne dla różnych stanów chorobowych (19).

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2008-12-03
zaakceptowano do druku: 2009-01-07

Adres do korespondencji:
*Jerzy Ostrowski Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego,
Klinika Gastroenterologii i Hepatologii w Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa
tel.: (0-22) 546-25-75
e-mail: jostrow@warman.com.pl

Postępy Nauk Medycznych 2/2009
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych