Ludzkie koronawirusy - autor: Krzysztof Pyrć z Zakładu Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków

Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Fitoterapii 3/2016, s. 159-166
Magdalena Wyszkowska-Kolatko, Paulina Koczurkiewicz, *Elżbieta Pękala
Badania in vitro nad cytotoksycznością olejku z drzewa herbacianego
Cytotoxic effect of tea tree oil – in vitro studies
Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, Kraków
Kierownik Zakładu: dr hab. n. farm. Elżbieta Pękala
Streszczenie
Wstęp. Olejek z drzewa herbacianego (TTO) jest otrzymywany z liści rośliny Melaleuca alternifolia, krzewu należącego do rodziny Myrtaceae. Lecznicze właściwości TTO są znane i wykorzystywane od dawna w terapii wielu chorób dermatologicznych: trudno gojących się ran, trądziku pospolitego, łuszczycy, grzybicy paznokci, a nawet opryszczki zwykłej. Wiele badań dowodzi działania przeciwdrobnoustrojowego, przeciwgrzybiczego i przeciwzapalnego olejku, jednak istnieje niewiele danych dotyczących bezpieczeństwa jego stosowania.
Cel pracy. Celem badań było określenie cytotoksyczności TTO w stosunku do linii komórkowej piersi: prawidłowej (MCF10a) i nowotworowej (MCF7) oraz linii komórkowej prostaty: prawidłowej (PNT2) i nowotworowej (DU145).
Materiał i metody. Komórki wszystkich linii komórkowych były inkubowane w obecności TTO, w stężeniach od 0,002 do 0,05% przez 24 godz. Do oszacowania cytotoksyczności olejku wykorzystano test z błękitem trypanu i test redukcji soli tetrazolowej do formazanu (MTT).
Wyniki. Wyniki badań wskazują, że wraz z rosnącym stężeniem olejku, żywotność badanych komórek maleje. Najbardziej wrażliwe na działanie olejku okazały się linie MCF10a i DU145, a znacznie mniejszą wrażliwość wykazały linie MCF7 oraz PNT2.
Wnioski. Pomimo że TTO jest produktem naturalnym, stosowanym od bardzo dawna i ma udokumentowane właściwości lecznicze, to istnieje niewiele prac na temat bezpieczeństwa jego stosowania. Ze względu na dostępność nowych metod badawczych niezwykle ważne jest, aby prowadzić dalsze badania dotyczące bezpieczeństwa stosowania naturalnych środków aktywnych, wykorzystywanych w terapii chorób dermatologicznych.
Summary
Introduction. Tea tree oil (TTO) is an essential oil obtained from Melaleuca alternifolia, which is a species of shrub belonging to family Myrtaceae. The healing properties of TTO are widely used in many skin diseases: wound healing, acne vulgaris, psoriasis, onychomycosis and even herpes simplex. Many studies have proved antimicrobial antifungal, and anti-inflammatory activity of TTO, but despite the widespread use of oil in many medicinal and cosmetic formulations, there is little research on the safety of it.
Aim. The aim of the study was to investigate the cytotoxic activity of TTO against human normal cell lines derived from prostate (PNT2) and breast (MCF10a), and human cancer cell lines also derived from prostate (DU145) and breast (MCF7).
Material and methods. Each cells were incubated in the presence of TTO in concentration range 0.002-0.05% for 24 hours. The cytotoxic potential of TTO was examined using trypan blue exclusion test as well as MTT test.
Results. Results showed that with increasing concentrations of TTO, the number of living cells is decreasing. Most sensitive to the cytotoxic effect of TTO were MCF10a and DU145 cell lines, while MCF 7a and PNT2 cell lines were less sensitive.
Conclusions. Despite of the TTO is natural essential oil, well known and widely used, the results of our research showed that, applying it at high concentrations on the skin, can be dangerous for some of human cells. Further investigations are necessary.
Wprowadzenie
Olejek z drzewa herbacianego (ang. tea tree oil – TTO) otrzymywany jest z rośliny Melaleuca alternifolia, krzewu należącego do rodziny Myrtaceae (Mirtowate), który w warunkach naturalnych rośnie w Australii i Nowej Zelandii (1). Nazwa „drzewo herbaciane” została nadana przez kapitana Jamesa Cooka, który na wzór Aborygenów parzył z liści tego krzewu napój podobny do herbaty (2). Olejek pozyskuje się z naprzeciwlegle ułożonych liści, kształtu lancetowatego, bogato wyposażonych w gruczoły olejkowe. Do produkcji olejku eterycznego zbierane są głównie gałązki szczytowe krzewu, zawierające największe ilości tego składnika (1). Olejek pozyskiwany jest metodą destylacji z parą wodną liści zebranych w okresie od listopada do maja (1, 3, 4).
Olejek z drzewa herbacianego jest znany i stosowany od dawna. Początkowo wykorzystywany był w terapii trudno gojących się, zakażonych ran. Współcześnie zaleca się go do leczenia chorób skóry i jej przydatków, m.in. trądziku pospolitego, łupieżu, łuszczycy, łojotokowego zapalenia skóry, odcisków, grzybicy stóp, grzybicy skóry głowy, drożdżycy paznokci, owrzodzeń cukrzycowych i żylakowych, zakażonych ran, oparzeń, czyraków i zanokcicy. Wykorzystywany jest do leczenia zakażeń bakteryjnych i grzybiczych jamy ustnej, zakażeń dróg oddechowych (inhalacje), coraz częściej w ginekologii (zakażenia pochwy), w chorobach dróg moczowych, hemoroidach, a także w zwalczaniu robaczyc (3-6). Wiele badań udowodniło przeciwbakteryjne (Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes), przeciwgrzybicze (Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum gypseum) i przeciwzapalne działanie olejku z drzewa herbacianego (3, 5-11).
Olejek z drzewa herbacianego zawiera około 100 związków, z czego większość stanowią monoterpeny (6). Głównym jego składnikiem jest terpinen-4-ol (29-45%), który decyduje o sile działania przeciwdrobnoustrojowego olejku. W znaczących ilościach w składzie olejku występują: γ-terpinen (12-23%), α-terpinen (8-11%), α-terpineol (2-7%) i monoterpeny: 1,8-cyneol (2-16%), p-cymen (1-12%), α-pinen (2-5%) oraz limonen (1-6%). W niewielkich ilościach (0,1-2%) w olejku z drzewa herbacianego znajdują się również inne monoterpeny: β-pinen, myrcen, α-felandren, a także seskwiterpeny: aromadendren, wiridifloren i δ-kadynen (1).
Wytyczne australijskie narzucają ścisłe ograniczenia co do zawartości niektórych składników olejku. Minimalna ilość terpinen-4-olu, który wykazuje silne działanie przeciwdrobnoustrojowe i przeciwzapalne, powinna wynosić 30%. Z kolei maksymalna zawartość 1,8-cyneolu w olejku to 15%, ponieważ składnik ten jest odpowiedzialny za działanie drażniące na skórę. Ważnym związkiem, z punktu oceny świeżości olejku, jest p-cymen. W świeżo oddestylowanym olejku jest go niewiele (ok. 4%), jednak wraz z wydłużającym się czasem przechowywania jego zawartość wzrasta, po 21 miesiącach prawie 9-krotnie (ok. 35%) (1).
Zaskakuje fakt, że pomimo długoletniego stosowania olejku z drzewa herbacianego, istnieje niewiele informacji dotyczących jego bezpieczeństwa. Przegląd piśmiennictwa wskazuje, że zewnętrzne stosowanie olejku jest bezpieczne, działania niepożądane są niezwykle rzadkie i dotyczą niewielu osób. Zwraca się również uwagę, że olejek nie powinien być przyjmowany doustnie, a skórne efekty uboczne można ograniczyć, stosując niskie stężenia preparatu. Olejek z drzewa herbacianego najczęściej jest nakładany na skórę, a w związku z tym, że wykazuje charakter lipofilowy, dobrze rozpuszcza się w wydzielinie gruczołów łojowych i łatwo penetruje przez skórę. Wystarczy 10-30 min, aby olejek z powierzchni skóry trafił do krwiobiegu, układu limfatycznego i zakończeń nerwowych skóry. Co ważne, zaaplikowany miejscowo olejek, w trakcie przenikania przez warstwy skóry nie zmienia swojego składu chemicznego, zachowując w ten sposób aktywność biologiczną (3, 6, 8). Właśnie ze względu na wysoką penetrację olejku z drzewa herbacianego do wnętrza ludzkiego organizmu, słuszne wydaje się sprawdzanie bezpieczeństwa jego stosowania.
Hodowle komórkowe in vitro mają na celu namnażanie i utrzymywanie przy życiu komórek pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Badania z wykorzystaniem hodowli komórkowych używane są w pierwszym etapie badań nad nowymi substancjami biologicznie aktywnymi, przeprowadza się na nich wstępne badania przesiewowe (screening), które są alternatywą dla czasochłonnych, kosztownych i wymagających zgody Komisji Bioetycznej eksperymentów na zwierzętach. Rutynowo przeprowadza się badania wykorzystujące hodowle komórkowe, sprawdzające toksyczność substancji biologicznie aktywnych, jednak przy ich pomocy można również określić mechanizm wchłaniania, a także interakcje z innymi substancjami chemicznymi (np. lekami). Eksperymenty wykorzystujące hodowle komórkowe pozwalają na uzyskanie powtarzalnych i wiarygodnych wyników badań. W porównaniu z metodami in vivo, ogromną zaletą technik in vitro jest możliwość kontrolowania warunków doświadczalnych, poprzez modyfikowanie środowiska hodowli komórek. Chociaż prowadzone w kontrolowanych warunkach hodowle komórkowe wykorzystywane są jako wartościowy model, nie zastąpią jednak badań na żywych organizmach; te dwa modele badawcze mogą się doskonale uzupełniać (12).
Cel pracy
Celem badań było określenie potencjału cytotoksycznego olejku z drzewa herbacianego w stosunku do prawidłowych linii komórek piersi (MCF10a) i prostaty (PNT2), a także nowotworowych linii komórek piersi (MCF7) i prostaty (DU145).
Materiał i metody
Materiały i odczynniki
Materiały i odczynniki wykorzystane w trakcie prowadzonych badań przedstawiono w tabeli 1.
Tab. 1. Materiały i odczynniki stosowane w badaniach
Nazwa materiału lub odczynnikaFirma
Zestaw do analizy cytotoksyczności MTT (MTT Cell Proliferation Assay Kit)Caymann
Barwnik błękit trypanu (Trypan blue solution 0,4%)Sigma Aldrich
Medium hodowlane DMEM (Medium DMEM Low Glucose)Pan Biotech
Medium hodowlane DMEM F-12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient F-12 Ham)Sigma Aldrich
Medium hodowlane RPMI (Medium RPMI)Sigma Aldrich
Roztwór soli fizjologicznej (PBS)Pan Biotech
Antybiotyk: mieszanina penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny BPan Biotech
Glutamina (L-Glutamine)Pan Biotech
Surowica bydlęca (FBS)Pan Biotech
Trypsyna (Trypsin/EDTA)Pan Biotech
Płytka 12-dołkowa (Tissue culture test plate)Spl Life Science
Płytka 96-dołkowa (Tissue culture test plate)Spl Life Science
Butelka do hodowli komórkowych (Cell culture flask) 25 cm2, 75 cm2Spl Life Science
Linie komórkowe
W eksperymencie wykorzystano 4 linie komórkowe. Ich nazwy i pochodzenie oraz media hodowlane zamieszczono w tabeli 2.
Tab. 2. Linie komórkowe i media hodowlane
Symbol linii komórkowejNazwa linii komórkowejSygnatura liniiRodzaj medium hodowlanego
MCF10aprawidłowe komórki piersiCRL 10317 (ATCC)DMEM
MCF7nowotworowe komórki piersiHTB-22 (ATCC)DMEM
PNT2prawidłowe komórki prostaty ludzkiej95012613 (Sigma-Aldrich St. Louis)RPMI
DU145nowotworowe komórki prostaty ludzkiejHTB-81 (ATCC)DMEM F-12
Hodowle komórkowe
Hodowlę komórek prowadzono w inkubatorze w warunkach standardowych (temp. 37°C w atmosferze 5% CO2). Komórki były poddawane rutynowym procedurom pasażu (linie komórek nowotworowych wymagały pasażu co 3 dni, natomiast linie komórek prawidłowych co 4 dni). Każda linia była hodowana w zdefiniowanym medium (tab. 2) z dodatkiem 5% surowicy bydlęcej (FBS) oraz mieszaniny antybiotyków: penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B.
Roztwory podstawowe i robocze olejku z drzewa herbacianego
Do przeprowadzenia eksperymentu losowo wybrano olejek z drzewa herbacianego od jednego z producentów dostępnych na rynku polskim.
W celu przygotowania 1% roztworu podstawowego 10 μl olejku z drzewa herbacianego rozpuszczono w 990 μl 40% etanolu. Natomiast 0,1% roztwór roboczy otrzymano poprzez zmieszanie 100 μl roztworu podstawowego z 900 μl roztworu soli fizjologicznej. Wszystkie roztwory olejku z drzewa herbacianego zostały przygotowane w warunkach aseptycznych.
Badanie żywotności
Test z błękitem trypanu
1. Komórki wysiano na płytki 12-dołkowe w liczbie 3•103 komórek/dołek i po 24 godz. od wysiania w dołkach wymieniono płyn na świeży (kontrola) oraz zawierający odpowiednie stężenia olejku. Następnie komórki inkubowano w obecności olejku przez 24 godz.

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 30 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Kędzia B, Alkiewicz J, Han S. Znaczenie olejku z drzewa herbacianego w fitoterapii. Cz. I. Skład olejku i jego właściwości biologiczne. Post Fitoter 2000; (2):36-40. 2. Aburjal T, Natsheh FM. Plants used in cosmetics. Phytother Res 2003; 17:987-1000. 3. Garbusińska A, Mertas A, Król W. Przegląd badań in vitro oceniających aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku z drzewa herbacianego (Tea Tree oil). Cz. I. Post Fitoter 2010; (2):85-96. 4. Pisulewska E, Janeczko Z. Krajowe rośliny olejkowe. Wyd ,,Know-How”, Kraków 2008. 5. Enshaieh S, Jooya A, Siadat H i wsp. The efiicacy of 5% topical tea tree oil gel in mild to moderate acne vulgaris: a randomized, double-blind placebo controlled study. Indian J Dermatol Venerol Leprol 2007; 73(1):22-6. 6. Pazyar N, Yaghoobi R, Bagherani N i wsp. A review of applications of tea tree oil in dermatology. Int J Dermatol 2012; 52:784-90. 7. Kanlayavattanakul M, Lourith N. Therapeutic agents and herbs in topical application for acne treatment. Intern J Cosmetic Sci 2011; 33:289-97. 8. Kędzia B, Alkiewicz J, Han S. Znaczenie olejku z drzewa herbacianego w fitoterapii. Cz. II. Skład olejku i jego właściwości biologiczne. Post Fitoter 2000; (3):33-7. 9. Reuter J, Wolfle U, Weckesser S i wsp. Which plant for which skin disease? Part 1: Atopic dermatitis, psoriasis, acne, condyloma and herpes simplex. J Dtsch Dermatol Gesselsch 2010; 8:788-96. 10. Martin KW, Ernst W. Herbal medicines for treatment of bacterial infections: a review of controlled clinical trials. J Antimicrob Chemother 2003; 51:241-6. 11. Martin KW, Ernst E. Herbal medicines for treatment of fungal infections: a systematic review of controlled clinical trials. Mycoses 2004; 47:87-92. 12. Stasiak P, Sznitowska M. Zastosowanie hodowli komórkowych w badaniach biofarmaceutycznych. Farm Pol 2010; 66(3):228-34. 13. Noszczyk M. Kosmetologia pielęgnacyjna i lekarska. Wyd Lek PZWL, Warszawa 2011.
otrzymano: 2016-01-10
zaakceptowano do druku: 2016-06-01

Adres do korespondencji:
*dr hab. n. farm. Elżbieta Pękala
Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Wydział Farmaceutyczny Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum
ul. Medyczna 9, 30-688 Kraków
tel.: +48 (12) 620-55-98
e-mail: elzbieta.pekala@uj.edu.pl

Postępy Fitoterapii 3/2016
Strona internetowa czasopisma Postępy Fitoterapii