Ponad 7000 publikacji medycznych!
Statystyki za 2021 rok:
odsłony: 8 805 378
Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 4/2014, s. 225-230
Robert Dębski1, 2, Łukasz Sędek3, Anna Jaworska-Posadzy1, Alicja Sonsala3, Andrzej Kołtan1, 2, Tomasz Szczepański3, Monika Pogorzała1, 2, Mariusz Wysocki1, 2, *Jan Styczyński1, 2
Monitorowanie i walidacja minimalnej choroby resztkowej metodą cytometrii przepływowej w ostrej białaczce limfoblastycznej u dzieci
Flow cytometry monitoring and validation of minimal residual diseases in childhood acute lymphoblastic leukemia
1Katedra Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz
Kierownik Katedry: prof. dr hab. med. Mariusz Wysocki
2Szpital Uniwersytecki nr 1 im. Jurasza, Bydgoszcz
Dyrektor Szpitala: mgr Jacek Kryś
3Katedra Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Zabrze
Kierownik Katedry: prof. dr hab. med. Tomasz Szczepański
Streszczenie
Wstęp. Minimalna choroba resztkowa to obecność przetrwałych w organizmie komórek nowotworowych.
Cel pracy. Ocena minimalnej choroby resztkowej (MRD) u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) metodą cytometrii przepływowej w lokalnym laboratorium i jej walidacja w laboratorium referencyjnym.
Materiał i metody. Badaniem objęto 30 kolejnych pacjentów z nowo rozpoznaną ALL. Badania przeprowadzano w Pracowni Onkologii Klinicznej i Eksperymentalnej w Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii w Bydgoszczy, a walidację tych wyników wykonywano w Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej w Zabrzu. Pacjentów zaklasyfikowano do trzech grup: grupa I – MRD < 0,1%, grupa II – MRD = 0,1-10%, grupa III – MRD > 10%.
Wyniki. Wartości MRD uzyskiwane lokalnie wykazywały silną korelację z wynikami uzyskanymi w Zabrzu w dniu 15. i 33. (p < 0,01). Wyniki otrzymane w ośrodku bydgoskim w dniu 15. miały wyższą wartość u 9 pacjentów, niższą u 17 pacjentów i taką samą u 2 pacjentów. Natomiast w dniu 33. wyniki otrzymane w Bydgoszczy miały wyższą wartość u 20 pacjentów, niższą u 3 pacjentów i taką samą u 5 pacjentów. W przypadku 4 na 5 pacjentów, którzy zostali przekwalifikowani w 15. dniu terapii z grupy SR do IR, poziom MRD w Bydgoszczy i Zabrzu był podobny. W przypadku pacjenta, którego przekwalifikowano w 15. dniu terapii z grupy IR do HR, poziom MRD w Bydgoszczy był w drugim przedziale, natomiast w Zabrzu w przedziale trzecim. W 33. dniu terapii na podstawie diagnozy MRD > 10% w Bydgoszczy jednego z pacjentów przeklasyfikowano z IR do HR. W Zabrzu wartość MRD mieściła się w drugim przedziale.
Wnioski. Wartości MRD oznaczanej w Klinice w Bydgoszczy są porównywalne z wynikami otrzymanymi w ośrodku referencyjnym.
Summary
Introduction. Minimal residual disease denotes the persistence of malignant cells in the patient body.
Aim. Assessment of flow cytometry minimal residual disease (MRD) in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) in local laboratory and its validation in reference laboratory.
Material and methods. 30 consecutive patients with ALL. MRD was analyzed in Department of Pediatric Hematology and Oncology in Bydgoszcz, and validated in Department of Pediatric Hematology and Oncology in Zabrze. MRD results were qualified as: group I – MRD < 0.1%, group II – MRD = 0.1-10%, group III – MRD > 10%.
Results. MRD values obtained locally had strong correlations with the results from reference laboratory at days 15 and 33 (p < 0.01). MRD values obtained locally at day 15 were higher in 9 patients, lower in 17 patients and identical in 2 patients. At day 33, respective values were higher in 20 patients, lower in 3 patients and identical in 5 patients. In 4/5 patients, re-distributed at day 15 from SR to IR, MRD levels in Bydgoszcz and Zabrze were identical. In patient re-distributed at day 15 from IR to HR, the MRD value was assessed to group 2 in Bydgoszcz, and to group 3 in Zabrze. At day 33 patient re-distributed from IR to HR was assessed as group 3 in Bydgoszcz, and as group 2 in Zabrze.
Conclusions. MRD values determined in Bydgoszcz are comparable with results in reference laboratory.
Wstęp
Radykalna poprawa skuteczności leczenia ostrej białaczki limfoblastycznej (ang. acute lymphoblastic leukemia – ALL) u dzieci, jaka dokonała się w ostatnich trzech dekadach, pozwalająca uzyskać długotrwałą remisję u ponad 80% pacjentów, sprawiła, że obecne wysiłki lekarzy skupiają się z jednej strony na zmniejszeniu toksyczności terapii do niezbędnego minimum, z drugiej do uzyskania remisji lub na zapobieżeniu wznowie u pozostałego odsetka leczonych. Dla obydwu tych działań istotne znaczenie ma określenie ilości przetrwałych w organizmie komórek nowotworowych, tzw. minimalnej choroby resztkowej (ang. minimal residual disease – MRD).
Ze względu na liczne doświadczenia, standaryzację oraz wysoką swoistość i czułość, zastosowanie mają tu głównie dwie techniki: cytometryczna oraz molekularna. Cytometryczna ocena MRD polega na analizie immunofenotypów charakterystycznych dla komórek białaczkowych. Do monitorowania MRD przy pomocy techniki polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) wykorzystuje się klonalne rearanżacje genów antygenu-receptora i/lub strukturalne aberracje chromosomalne (charakterystyczne miejsca złamań chromosomów prowadzące do powstania genów fuzyjnych). Wielokrotnie potwierdzano korelację obu technik u chorych z ALL (1-4). Obie metody pozwalają na wykrycie jednej komórki białaczkowej na 105 zdrowych komórek (zakres czułości od 10-4 do 10-6). Połączenie obu metod pozwala na monitorowanie MRD właściwie u wszystkich pacjentów z ALL, zapobiega też uzyskiwaniu wyników fałszywie negatywnych, na skutek ewolucji klonalnej lub zmian fenotypowych.
W chwili obecnej uważa się, że minimalna choroba resztkowa jest jednym z najistotniejszych czynników prognostycznych w dziecięcych ostrych białaczkach. Na jej podstawie możliwa jest nowoczesna stratyfikacja pacjentów do grup ryzyka nawrotu choroby. Niski poziom MRD lub jej brak pod koniec leczenia indukującego związany jest z dobrym rokowaniem, natomiast ryzyko wystąpienia wznowy jest proporcjonalne do poziomu MRD (5-6). Istotne znaczenie prognostyczne ma także monitorowanie MRD u dzieci z ALL z grupy wysokiego ryzyka poddawanych allogenicznemu przeszczepieniu komórek krwiotwórczych i u pacjentów po wznowie ALL (7). Wykazano, że klasyfikacja oparta na wynikach MRD pozwala skuteczniej wyodrębnić pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia wznowy ALL niż podział oparty na badaniach cytomorfologicznych i klinicznych (1, 4, 8).
Cytometria przepływowa jest metodą dostępną w każdym ośrodku hematologicznym, stale doskonaloną i rozwijaną. Obecnie umożliwia ona detekcję komórek z czułością 10-4 do 10-5. Rozróżnienie komórek nowotworowych od prekursorów komórek hematopoetycznych możliwe jest dzięki tzw. specyficznym immunofenotypom białaczkowym (ang. leukemia-associated immunophenotypes – LAIPs) (1, 8, 9). Są to charakterystyczne zaburzenia w zakresie antygenów, w których wyróżniamy:
– występowanie na badanych komórkach antygenów charakterystycznych dla innej linii komórkowej (koekspresja) (linii T na limfoblastach linii B i vice versa, a w przypadku ALL także antygenów z linii mieloidalnych) (8, 10),
– jednoczesną obecność antygenów, prawidłowo występujących na etapach różnicowania/dojrzewania komórki (asynchronia) (10, 11),
– nadmierną ekspresję antygenów,
– obniżenie ekspresji antygenów lub jej brak (8, 9).
Połączenie szeregu nieprawidłowości ekspresji antygenów białaczkowych powoduje, że zajmują one tzw. „puste przestrzenie” (ang. empty spaces) w porównaniu do prawidłowej ontogenezy limfocytu, co pozwala na poszukiwanie w szpiku remisyjnym tej nieprawidłowej populacji w ilościach śladowych (8, 10, 11).
Cel pracy
W pracy podjęto próbę oceny MRD u dzieci z ALL metodą cytometrii przepływowej i skonfrontowano wyniki uzyskane w lokalnym laboratorium z wynikami uzyskanymi w laboratorium referencyjnym, a także sprawdzono, jaki wpływ miało oznaczanie MRD w klasyfikacji pacjentów do grup ryzyka.
Materiał i metody
Pacjenci
Badaniem objęto 30 kolejnych pacjentów z nowo rozpoznaną ALL leczonych w Katedrze i Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii w Bydgoszczy od sierpnia 2010 do grudnia 2012 roku. Grupę stanowiło 20 chłopców i 10 dziewcząt w wieku 0,6-18 lat (mediana 4,5). Ponad połowę pacjentów (53,3%) stanowili chłopcy w wieku 2-5 lat. W analizowanym okresie w leczeniu pacjentów powyżej pierwszego roku życia stosowane były dwa programy terapeutyczne: ALL-IC-2002 (n = 9), a od kwietnia 2011 roku – ALL-IC-2009 (n = 20) (12, 13). Dzieci poniżej pierwszego roku życia leczone były według programu Interfant-06 (n = 1) (14).
Materiał
Materiałem badanym w niniejszej analizie był szpik kostny (w przypadku pacjentów z ALL wykazano wyższą zawartość MRD w szpiku kostnym niż we krwi obwodowej) (15). Preparatykę przeprowadzano w ciągu 2 godzin od pobrania materiału od pacjenta. Analizę fenotypu przeprowadzano w momencie rozpoznania, a następnie w 15. i 33. dobie leczenia. Za każdym razem standardowo wykonywano badanie mielogramu.
Badanie cytometryczne
Badania przeprowadzano w Pracowni Onkologii Klinicznej i Eksperymentalnej Katedry Pediatrii, Hematologii i Onkologii Collegium Medicum w Bydgoszczy przy użyciu cytometrów przepływowych Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, Miami, FL, USA – laser 488 nm; 5 zakresów fluorescencji) lub Becton Dickinson FACS Canto™ II (lasery 488 nm i 405 nm oraz laser diodowy 405 nm; 8 zakresów fluorescencji). Akwizycja i analiza danych odbywała się w systemie System II (Coulter) lub FACS Diva (Becton Dickinson). Analizę przeprowadzano zgodnie z zaleceniami producentów przeciwciał monoklonalnych oraz wzorując się na dostępnych zaleceniach grupy EuroFlow (16, 17) i BFM (11).
Badanie przeprowadzano z użyciem 0,3-1 mln komórek w zawiesinie o stężeniu 0,5-2,5 x 106 leukocytów/ml. Badanie przeprowadzano metodą „lyse, no wash” z lizą erytrocytów odczynnikiem UtiLyse (DAKO, Glostrup, Dania) lub „lyse and wash” z użyciem FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, Heidelberg, Niemcy). W przypadku jednoczesnej oceny antygenów wewnątrzkomórkowych preparatykę uzupełniano permeabilizacją błon komórkowych przy użyciu odczynników Fix&Perm (Invitrogen, Camarillo, USA).
Do diagnostyki immunologicznej w momencie rozpoznania wykorzystywano szeroki panel przeciwciał (CD1a, CD2, cyCD3, sCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD56, CD64, CD79-alfa, CD117, łańcuchy kappa i lambda, MPO, TdT). Za kryterium obecności badanej determinanty na komórce przyjęto jej ekspresję na powierzchni co najmniej 20% komórek. Okresowo wykonano badanie kontroli izotypowej, która umożliwiła właściwe odcięcie komórek z dodatnią ekspresją antygenu. Podtypy ostrych białaczek limfoblastycznych klasyfikowano zgodnie z wytycznymi programów ALL-BFM (11).
Badania cytometryczne przeprowadzano, stosując stałe zestawy przeciwciał, dostosowane do linii klonu nowotworowego limfoblastów. W ALL z linii B stosowano następujące zestawy: CD19/CD10/CD20/CD45, CD20/CD10/CD19/CD34, CD58/CD10/CD19/CD34, CD58/CD10/CD19/CD45, CD10/CD34/CD19/CD45, CD10/CD20/CD19/CD45/CD34, TdT/CD10/CD19, natomiast w ALL z linii T stosowano: CD7/sCD3/cCD3, TdT/CD7/sCD3/cCD3, CD4/CD8/CD45/CD3, CD99/CD7/CD5/sCD3/cCD3 (11). Pacjentów zaklasyfikowano do trzech grup: grupa I – MRD < 0,1% (< 10-3), grupa II – MRD 0,1-10% (10-3 do 10-1), grupa III – MRD > 10% (> 10-1).
Walidacja wyników w ośrodku referencyjnym
Równolegle do analizy minimalnej choroby resztkowej prowadzonej w Katedrze Pediatrii, Hematologii i Onkologii w Bydgoszczy przeprowadzano walidację jej wyników za pomocą 8-kolorowej cytometrii przepływowej w ośrodku referencyjnym, posiadającym europejską akredytację cytometryczną EuroFlow (16, 17), tj. w Katedrze i Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Zabrzu. W celu przeprowadzenia walidacji wyników, 5 ml szpiku kostnego pobrane na EDTA w dniu rozpoznania ostrej białaczki limfoblastycznej oraz w 15. i 33. dniu leczenia przesyłano w ciągu 24-48 godzin do Kliniki w Zabrzu.
Analiza statystyczna
Różnice pomiędzy grupami oceniono testem chi-kwadrat lub testem Fishera. Walidację wyników MRD w ośrodku referencyjnym oceniono testem korelacji Spearmana oraz testem par Wilcoxona.
Wyniki
Fenotyp komórek białaczkowych

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
  • Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
  • Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
  • Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.

Opcja #1

19

Wybieram
  • dostęp do tego artykułu
  • dostęp na 7 dni

uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony

Opcja #2

49

Wybieram
  • dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
  • dostęp na 30 dni
  • najpopularniejsza opcja

Opcja #3

119

Wybieram
  • dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
  • dostęp na 90 dni
  • oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Coustan-Smith E, Campana D: Immunologic minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia: A comparative approach to molecular testing. Clin Haematol 2010; 23: 347-358.
2. Kerst G, Kreyenberg H, Roth C: Concurrent detection of minimal residual disease (MRD) in childhood acute lymphoblastic leukaemia by flow cytometry and real-time PCR. Br J Haematol 2005; 128: 774-782.
3. Malec M, van der Velden VHJ, Bjorklund E et al.: Analysis of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia: comparison between RQ-PCR analysis of Ig/TcR gene rearrangements and multicolor flow cytometric immunophenotyping. Leukemia 2004; 18: 1630-1636.
4. Morley AA, Latham S, Brisco MJ et al.: Sensitive and specific measurement of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. J Mol Diagn 2009; 11: 201-210.
5. Bruggemann M, Schrauder A, Raff T et al.: Standardized MRD quantification in European ALL trials: Proceedings of the Second International Symposium on MRD assessment in Kiel, Germany, 18-20 September 2008. Leukemia 2010; 24: 521-535.
6. Coustan-Smith E, Sancho J, Behm FG: Prognostic importance of measuring early clearance of leukemic cells by flow cytometry in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: 52-58.
7. Krejci O, van der Velden V, Bader P et al.: Level of minimal residual disease prior to haematopoietic stem cell transplantation predicts prognosis in paediatric patients with acute lymphoblastic leukaemia: a report of the Pre-BMT MRD Study Group. Bone Marrow Transplant 2003; 32: 849-851.
8. Szczepański T, Orfao A, van der Velden VHJ et al.: Minimal residual disease in leukaemia patients. Lancet Oncol 2001; 2: 409-417.
9. Seegmiller AC, Kroft SH, Karandikar NJ et al.: Characterization of immunophenotypic aberrancies in 200 cases of B acute lymphoblastic leukemia. Am J Clin Pathol 2009; 132: 940-949.
10. Campana D, Coustan-Smith E: Minimal residual disease studies by flow cytometry in acute leukemia. Acta Haematol 2004; 112: 8-15.
11. Dworzak MN, Gaipa G, Ratei R et al.: Standardization of flow cytometric minimal residual disease evaluation in acute lymphoblastic leukemia: Multicentric assessment is feasible. Cytometry B Clin Cytom 2008; 74: 331-340.
12. ALL IC-BFM 2002: A Randomized Trial of the I-BFM-SG for the Management of Childhood non-B Acute Lymphoblastic Leukemia. Hannover, 3 May 2002.
13. ALL IC-BFM 2009: A randomized trial of the I-BFM-SG for the management of childhood non-B acute lymphoblastic leukemia. Kiel, 14 August 2009.
14. Intefant-06: International collaborative treatment protocol for infants under one year with acute lymphoblastic or biphenotypic leukemia. Rotterdam, 10-11 November 2005.
15. Zhou J, Goldwasser MA, Li A et al.: Quantitative analysis of minimal residual disease predicts relapse in children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia in DFCIALL Consortium Protocol 95-01. Blood 2007; 110: 1607-1611.
16. Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VH et al.: EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia 2012; 26: 1986-2010.
17. van Dongen JJ, Lhermitte L, Böttcher S et al.: EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 2012; 26: 1908-1975.
18. Ratei R, Basso G, Dworzak M et al.: AIEOP-BFM-FCM-MRD-Study Group. Monitoring treatment response of childhood precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia in the AIEOP-BFM-ALL 2000 protocol with multiparameter flow cytometry: predictive impact of early blast reduction on the remission status after induction. Leukemia 2009; 23: 528-534.
19. Conter V, Bartram CR, Valsecchi MG et al.: Molecular response to treatment redefines all prognostic factors in children and adolescents with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: results in 3184 patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study. Blood 2010; 115: 3206-3214.
otrzymano: 2014-02-07
zaakceptowano do druku: 2014-03-20

Adres do korespondencji:
*Jan Styczyński
Katedra Pediatrii, Hematologii i Onkologii Collegium Medicum Uniwersytet Mikołaja Kopernika
ul. Curie-Skłodowskiej 9, 85-094 Bydgoszcz
tel. +48 (52) 585-48-60
jstyczynski@cm.umk.pl

Postępy Nauk Medycznych 4/2014
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych

Pozostałe artykuły z numeru 4/2014: